吗啡作为阿片类药物，在镇痛、镇静、麻醉、止泻、治疗心源性哮喘等多个方面都有很高的临床价值，但是阿片类药物也带来很多问题，如耐受、痛觉过敏、呼吸抑制、成瘾等。在阿片类药物成瘾过程中伴随着相应受体、神经递质、信号通路、基因表达以及突触可塑性等方面的变化。本课题拟研究组胺H3受体拮抗剂THIO对吗啡成瘾小鼠精神依赖行为的影响,以及对杏仁核中多巴胺神经纤维多巴胺递质量和多巴胺受体D2R数量、神经纤维数量和密度、突触蛋白Synapsin 1含量的影响。为组胺H3受体拮抗剂用于吗啡成瘾类疾病提供实验依据。

（一）组胺H3受体阻断剂THIO对吗啡成瘾小鼠精神依赖行为的影响

  建立小鼠吗啡成瘾模型，脑立体定位杏仁核并微量注射组胺及组胺H3受体拮抗剂THIO，通过条件性位置偏爱( conditioned place preference ,CPP)检测THIO对吗啡成瘾精神依赖行为的影响。

（二）组胺H3受体拮抗剂对吗啡成瘾小鼠杏仁核中多巴胺神经纤维的影响

  通过免疫组织化学等形态学研究技术检测杏仁核内多巴胺神经元的数量、形态的变化，通过Western Blot、ELISA等蛋白检测技术测试酪氨酸羟化酶、多巴胺、D2受体、突触蛋白Synapsin 1表达变化，明确THIO对杏仁核中多巴胺神经纤维的影响。

实验步骤:

一.动物处理：

C57小鼠50只(雄性)，体质量18～25 g。自由进食进水，动物房温度22～24℃，适应7d。动物随机分为4组。

对照组：注射生理盐水10mL／kg，每天2次；

吗啡成瘾组：给予吗啡的方法、剂量以及持续时间按前期预实验（15mg/Kg,7d）。

吗啡成瘾+组胺组：预先给予杏仁核区埋管，给予吗啡（15mg/Kg,7d）腹腔注射的第4天开始杏仁核区微量注射组胺。

吗啡成瘾+THIO组：给予吗啡（15mg/Kg,7d）腹腔注射的第4天开始杏仁核区微量立体定位注射组胺H3受体拮抗剂THIO。

二.条件性位置偏爱(conditioned place preference ,CPP)实验

实验分为三个阶段：pretest阶段、Conditioning阶段、posttest阶段。

1.CPP装置分为A、B两个区域，A区为给药区，B区为生理盐水区。

2.先让小鼠适应环境，合笼适应三天，单笼后适应一天。

3.pretest阶段：

测量小鼠的初始偏好。第一天从A区放入，第二天从B区放入。让小鼠在A、B两区自由探索15min。记录小鼠在A、B两个区域的停留时间，计算药物室/盐水室的时间比，比值大于1.5或小于0.6的小鼠淘汰（淘汰后对小鼠进行分组，随机分为实验组和对照组）。

注意事项:

(1)小鼠放置时应让其不面向通道一侧墙面，且两天放置小鼠面对的墙面相对应不变。试验结束后将小鼠放回笼中，每只小鼠试验结束后用20%酒精擦拭内壁和底面，消除小鼠气味。

(2)小鼠自由探索期间打开A、B区之间的通道。

4.Conditioning阶段：

(1)每天上午八点、下午四点进行实验。

上午八点，实验组注射药物后，放入A区，封闭通道，让其在A区自由探索40min。对照组腹腔注射等体积的生理盐水，放入B区，封闭通道，让其在B区自由探索40min。实验组和对照组一一对应，同时进行实验。

下午四点，实验组腹腔注射与上午等体积生理盐水，放入B区，封闭通道，让其在B区自由探索40min。对照组腹腔注射等体积的生理盐水，放入A区，封闭通道，让其在A区自由探索40min。实验组和对照组一一对应，同时进行实验。

(2)实验进行六天，注射药物和生理盐水的时间交替进行。始终保持A区为给药区。

5.posttest阶段：

(1)打开通道，将小鼠放在通道中，面朝通道壁，让其自由探索15min，记录小鼠在A、B两个区域的停留时间，分析小鼠是否建立了位置偏好。

(2)试验时间应与前一天交替。

模型成功标准：Conditioning前后小鼠在药物室时间差（posttest-pretest）≥总时间（900s）的10% (注：时间相差100s比较成功)，即模型成功。

三.免疫荧光技术检测杏仁核区多巴胺神经神经纤维形态和数量变化。

四.Western Blot、 ELISA等蛋白检测技术测试氨酸羟化酶、多巴胺、D2受体、突触蛋白Synapsin 1表达变化。

吗啡等阿片类药物是一类强效镇痛剂，对手术或创伤后急性中重度疼痛、癌痛尤其有效。但是阿片类药物也带来很多问题，如耐受、痛觉过敏、呼吸抑制、成瘾等，其中阿片类药物成瘾发生率高，对个人、家庭及社会的危害极大。阿片类药物成瘾过程中伴随着相应受体、神经递质、信号通路、基因表达以及突触可塑性等方面的变化。目前对于阿片成瘾的研究主要集中于其躯体依赖性和精神依赖性。而大脑中的杏仁核不仅和痛觉本身有关,还参与吗啡的镇痛作用，若损毁动物单侧杏仁核,足底注射福尔马林引起疼痛后,吗啡在损毁同侧的镇痛作用消失；损毁单侧的中央杏仁核及基底外侧核,吗啡在损毁同侧的镇痛作用减弱,而在损毁对侧的镇痛作用不受影响^[1,2]。而一些研究者发现条件性诱发复吸与泛杏仁核(extended amygdala,包括杏仁核中央核、Nac壳部、终纹底核)和它与基底外侧杏仁核(basolateral amygdala,BLA)、中脑DA系统的传入通路有关^[3]。杏仁核与Nac共同参与药物线索介导的复吸。杏仁核作为边缘系统的皮质下中枢,在疼痛调制过程中起了关键作用，尤其是中央杏仁核（central amygdala,CeA），它又被称为“伤害感受性杏仁核”，具有强烈的感觉和情感维度。神经递质、神经肽、激素及相应受体参与杏仁核的疼痛调控^[4]。在杏仁核众多的神经核团中，中央杏仁核(CeA)参与觉醒、情感表达以及环境刺激与情感状态的形成。条件位置偏爱(CPP)的研究提出杏仁核在药物滥用导致的奖赏刺激中起着重要的作用^[5]。在解剖位置上,杏仁核联结着伏隔核(Nac)、并且接受来自中脑腹侧被盖区(VTA)高密度的多巴胺传入纤维和来自下丘脑后部的乳头核(TM )的组胺传入神经纤维^[2]。多巴胺神经纤维、组胺神经纤维以及胆碱等神经纤维在杏仁核中共存,这为中枢组胺(作为一种神经调质)与多巴胺、胆碱等多种神经纤维的相互作用提供了又一个解剖学的依据。前期研究指出杏仁核的多巴胺D2受体（D2R）介导了VTA-CeA通路^[6,10]，通过检测多巴胺D2受体（D2R）的数量从而反映VTA-CeA通路中多巴胺神经纤维的数量。

组胺是中枢神经系统中一种重要的神经递质或神经调质。组胺具有H1、H2、H3和H4四种受体，研究发现组胺H3受体（histamine H3 receptor, H3R）最为特别，它是一种自身受体，分布于组胺能神经元的胞体、树突、轴突以及其他一些神经元的轴突上，可以负反馈抑制组胺或其他神经递质的合成和释放。同时组胺H3R是G蛋白偶联受体家族的成员，能够通过激活下游多条蛋白通路发挥多种生理功能。有研究报道称组胺H3R可通过组胺非依赖性的途径加重缺血导致的脑损伤，而H3R拮抗剂可以在动物脑缺血时发挥神经保护作用^[7]。噻普酰胺( thioperamide，THIO)是第1个强效选择性H3受体拮抗剂，其与rH3受体具有较强的亲和力(pKi= 8.4)，与hH3受体亲和力相对较弱(pKi =7.2)^[8]但随后发现其与hH4 受体(pKi=7.3)、大鼠5-HT3(pKi=5.6)受体等其他受体也有较大的亲和性。现在THIO常作为典型的 H3 受体拮抗剂用于研究H3受体在体内的多种生物学作用^[9]。组胺H3R受体拮抗剂对吗啡成瘾小鼠杏仁核中多巴胺神经纤维的影响及对精神依赖的作用未见报道，相关分子机制仍待研究，而之前研究发现，戒断成瘾药物后所产生的痛苦与激活脑内另一个脑区杏仁核多巴胺系统有关，如果用THIO作用于组胺H3受体对杏仁核多巴胺系统进行干预，对减少“药物成瘾者”因环境因素导致的“药物复吸”顽症有重要临床意义。

[1] Volkow ND, Michaelides M, Baler R. The Neuroscience of Drug Reward and Addiction. Physiol Rev. 2019;99(4):2115-2140. doi:10.1152/physrev.00014.2018

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首次研究组胺H3受体拮抗剂THIO对吗啡成瘾小鼠杏仁核中多巴胺神经纤维的影响，明确THIO在吗啡成瘾小鼠病理生理过程中的作用，为组胺H3受体拮抗剂用于吗啡等阿片类成瘾类疾病提供实验依据；也为杏仁核在药物滥用导致的奖赏环路中的作用提供实验依据，目前还没有此研究的报道，具有较强的创新性。

技术路线：

拟解决的问题及预期结果：

1.理论成果： 

 通过分析组胺H3受体阻断剂THIO对吗啡成瘾小鼠精神依赖行为的影响，组胺H3受体拮抗剂对吗啡成瘾小鼠杏仁核中多巴胺神经纤维的影响,阐明组胺H3受体拮抗剂用于吗啡等阿片类成瘾类疾病提供实验依据。

2.实验与技术成果： 

  团队成员可以形成科学研究思路，并能熟练操作项目中所涉及实验方法。在预期的时间内完成相应的实验计划，总结实验数据，最终的研究成果将形成研究报告，并以论文形式发表SCI或CSCD核心论文1篇。

 2021.05—2021.08  确定研究方向，并建立团队对国内外相关资料、文献与研究成果进行学习、总结和交流，并系统的制定研究计划。

1.第一阶段(2021.5.20-2021.6.23) 项目申报阶段

2、第二阶段（2021年9月1号--2022年2月31日）

3、第三阶段（2022年3月1日--2022年4月28日）

  整理数据材料，修改不足之处，对不妥当的数据进行研究与讨论，并进行后期实验补足；填写结题表、撰写研究论文和总结报告、参加结题答辩等。