抗牛冠状病毒S1蛋白单链抗体的制备与应用

研究目的与意义

牛冠状病毒（Bovine coronavirus，BCoV）在世界范围内广泛流行，其引起的犊牛腹泻、成年牛冬痢和呼吸道疾病，是目前牛养殖业生产过程中面临的主要健康问题之一。BCoV感染的发病率一般在50%~100%，病死率为10%～50%，在牛群中的发病率随牛群及年代而有不同，有的牛群发病率在第1年较低为5%～10%，第2年可升高至20%～50%，第3年上升至50%～80%，起初散发继而呈暴发态势。临床上多以急性发作的水样腹泻为主要特征，病情较重时出现大量血液粪便、脱水和虚弱，甚至死亡，严重阻碍犊牛的生长发育。病毒感染后会导致犊牛免疫力下降，经常引起并发性细菌感染，出现犊牛猝死等病症，导致犊牛发生的腹泻更严重、死亡率更高、可达50%以上，最高死亡率可达100%。感染犊牛后引起的疾病具有发病率高、流行性广、危害性大等特点。冠状病毒以口粪途径传播，并能适宜低温的生长环境，寒冷的季节可导致病毒的积累，每年给养牛业业造成巨大经济损失。

目前国内尚无商品化疫苗和特效药物用于BCoV感染的防治，临床只能通过收敛止泻、平衡电解质、补充体液、抗菌消炎等对症治疗和支持疗法来提高成活率。因此，亟需一款针对BCoV的有效防止制剂。特异性抗体治疗是抗病毒的一种有效治疗方法，目前单链抗体（scFv）技术已被广泛应用于人类抗病毒和抗肿瘤治疗，取得显著效果。但是该技术在动物上应用较少。单链抗体（scFv）是人工合成小分子抗体的一种，通过一条富含甘氨酸的柔性短肽（linker）将抗体重链可变区和轻链可变区连接而成。scFv包含4个骨架区和3个互补决定区（CDR），其中由CDR组成的抗体识别和抗原结合部位，能决定抗体的特异性，因此，缺乏恒定区的scFv仍能稳定地与抗原特异性结合并发挥作用。王学飞等人在获得有广泛日本脑炎病毒反应交叉活性的单克隆体6B6C-1基础上，对重链可变区和轻链可变区基因进行拼接，获得其单链抗体基因，通过真核表达制备了治疗性的scFv。

本团队前期通过单克隆抗体制备技术已研制出能分泌抗BCoV S1蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，而且制备的单克隆抗体具有良好的抗病毒活性。因此，本研究拟在上述研究基础上制备出抗BCoV S1蛋白的重组scFv，通过制备工艺的优化达到可工厂化生产降低成本，实现可在临床治疗犊牛BCoV感染中推广的目的。本项目的实施不仅能够有效防控BCoV感染提高犊牛成活率，而且为scFv技术在动物上的应用提供宝贵经验。

研究内容

1.抗BCoV S1蛋白重组scFv的真核表达

1.1抗BCoV S1蛋白重组scFv基因SOE-PCR扩增

1.2 pcDNA-S1-scFv真核表达载体的构建

1.3 pcDNA-S1-scFv真核表达

2.抗BCoV S1蛋白重组scFv的生物学活性验证

2.1重组scFv的免疫检测效果评价

2.2重组scFv的抗BCoV效果评价

3.抗BCoV S1蛋白重组scFv的大规模生产工艺

3.1最佳真核表达载体的筛选

3.2最佳表达细胞株的筛选

3.3最佳培养工艺的筛选

国、内外研究现状和发展动态

牛冠状病毒（Bovine Coronavirus，BCoV），属于套氏病毒目，冠状病毒科，冠状病毒属 2a 亚群。BCoV 中发现了 16 个非结构蛋白（nsp1-16）（nsp1-16）及五种结构蛋白：血凝素-酯酶蛋白（HE）、S蛋白（S）、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）核衣壳蛋白（N）。S 蛋白大小为 150 KD，是病毒进入细胞、宿主范围、组织和细胞取向的重要决定因素。它也是刺激中和抗体的主要抗原，也存在细胞毒性淋巴细胞的重要靶位。N蛋白大小在 50 KD~60 KD，在不同BCoV 间同源性最强，经常用于分子诊断^[1]。

截至目前仍没有针对BCoV的特定治疗方法，也没有抗病毒药物，对该病的检测和预防方面研究较多。相关的免疫学检测和分子学诊断技术建立完善，如刘合义等建立了基于BCoV N蛋白的抗体间接ELISA，结果准确率高且操作简单，便于大规模检测^[2]。刘合义等建立了检测BCoV的RT-PCR，结果显示该方法反应速率快，特异性强^[3]。预防方面以疫苗接种为主，国内尚无BCoV的商品疫苗，但在国外日本、美国、俄罗斯，已有相关的商品疫苗流通。如俄罗斯研制的预防新生犊牛腹泻的四联灭活疫苗以及日本研制的BCoV灭活油佐剂疫苗，有的疫苗直接作用犊牛，提高犊牛自身免疫力^[4]。也有作用于妊娠后期的母牛，增强母源抗体水平，母源抗体通过初乳转移给犊牛，使其获得被动免疫保护^[5]。目前市面流通的商品化疫苗存在免疫时间短、继发肌炎等缺点，有一定的副作用，急需开发新的治疗方式。

对于动物疾病中病毒感染而言，抗病毒治疗十分关键，但是抗病毒药物却不尽人意。而在动物出现病毒性感染之后进行被动式的免疫，治疗效果尤为显著，通常是进行对应抗体的注射。其中工艺较简单的卵黄抗体，已成为许多病毒治疗的主要方式。如由鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）感染雏鸭引起的鸭病毒性肝炎，牛轮状病毒感染引起的犊牛腹泻，都已有相关卵黄抗体开发，并在临床治疗上有很好的效果^[6,7]。新冠肺炎(COVID-19)疫情期间，单克隆抗体疗法被迅速研发并应用于治疗高危患者，特别是在早期感染阶段，以减少病毒复制和严重病情的发展。单克隆抗体因其生产过程相对复杂，需要专业的设备和技术，生产效率低，成本过于昂贵，并未广泛与应用于市场。单链抗体（scFv）是一种基因工程抗体，由抗体重链可变区和轻链可变区通过柔性短肽链接组成的小分子，虽缺乏恒定区但仍能稳定地与抗原特异性结合，具有完整抗原结合活性的最小功能片段，与单克隆抗体制备相比，scFv可在大肠杆菌或乔氏短杆菌等原核生物中以低成本、高产量进行制备。近些年来被广泛应用于免疫诊断、抗病毒、靶向治疗等多个领域。

单链抗体在各领域展现出广阔的应用前景，主要得益于其结构简单、尺寸小巧的特点。与传统的单克隆抗体相比，单链抗体仅由一个抗体链组成，更容易渗透组织和穿越细胞膜，因此在药物输送和靶向治疗方面表现出独特优势。例如，在新型冠状病毒的防治方面，于凯凯等人在抗SARS-CoV-2 单克隆抗体的基础上，开发了生产成本更低和便于基因操作的抗 SARS-CoV-2单链抗体^[8]。基于一起暴发的诺如病毒（norovirus,No V）公共安全卫生事件，王璐等人通过采集大量患者体内的病毒核酸样本，构建人源噬菌体单链抗体库，以噬菌体展示技术筛选特异性GⅡ.17型诺如病毒单链抗体，并进行原核系统表达，得到中和性单链抗体，为NoV临床防治及相关疫苗研制提供依据^[9]。相比于单克隆抗体，单链抗体具备生产成本低、易于工程改造和优化等优势，可进一步开发多价抗体，因此在医药、生物技术和农业等领域的潜力巨大^[10]。

自首次使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞进行重组蛋白表达以来，生产工艺已经稳步改善，取得了许多进展。重组抗体表达最突出的宿主细胞系是CHO、NS0、Sp2/0、HEK293和PER.C6。然而，大多数实际生产都是关于CHO细胞的，它是当今70%工业生产的蛋白质疗法的主力。CHO细胞是生产蛋白类药物的首选宿主细胞，因为与其他系统相比，CHO 细胞具有以下优点^[9]：①对蛋白有准确的加工、修饰功能，其表达的蛋白质的生物学活性更接近于天然蛋白；②耐受剪切力和渗透压的能力相对较强；③整合外源基因后的细胞稳定，重组基因能高效扩增和表达^[11-14]。当前CHO细胞制备抗体药物工艺成熟，抗体表达量高，批式培养约可达1 g/L，流加补料培养可达1~15 g/L（1987年CHO 稳定株表达量0.1 g/L，2007年CHO稳定株表达量5 g/L，2015年CHO稳定株表达量10 g/L），单细胞分泌可达10 ~ 90 pg/(cell·d)^[15]。苏贤德等人研究对CHO细胞N-1种子灌流培养工艺和生产抗Tim3单抗CHO细胞高密度培养工艺进行小试工艺开发，实现了高效细胞培养抗体生产^[16]。也有对CHO 细胞N-1种子灌流培养和超高密度补料分批培养工艺小试和放大研究，实现了高效细胞培养抗体生产^[17]。

细胞培养技术在过去几十年中已经相当成熟，并发展成为一种相对可靠和强大的技术。有许多步骤需要优化，这些步骤协同促进了这项技术的成功利用，并以高数量和所需质量生产给定的重组蛋白，同时保持低生产成本。一个特别的里程碑是改进的化学定义培养基的开发和商业可用性，即使是在相当老的细胞系上也带来了有希望的结果，这些细胞系早在Bnew^培养基开发之前就已经建立起来了。然而，更高的成本和每个重组克隆的个体需求促使生物制药公司开发自己的培养基来优化他们的哺乳动物细胞技术平台。Jayapal等人(2007)分析了细胞培养技术的发展，并指出大约30年前，Bold生物过程通常以批处理模式操作一周，峰值细胞浓度为3×10^-6细胞/mL，重组蛋白产量约为100 mg/L。由于改进了基础培养基和饲料策略以补充耗尽的营养物质，最先进的工艺达到了相当长的工艺持续时间，更高的细胞密度和1-5 g/L的单抗滴度^[11]。如今，进一步的发展，如满足不同培养阶段（例如，生长和固定阶段)的不同需求的特定饲料浓缩物，使更高的细胞浓度和超过10 g/L的产品滴度成为现实^[18-20]。因此，通过生产工艺的优化以及培养基成本的降低，将使scFv制备成本将下，使其具有在动物上有推广应用价值。

参考文献:

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创新点与项目特色

1.本研究在国内外首次基于分泌抗BCoV S1蛋白的杂交瘤细胞基因组，创制出可用于治疗和检测BCoV感染的重组scFv。

2.本研究打破了传统单克隆抗体工厂化生产成本高昂，工艺复杂，体内副反应强，不适合临床防治疾病应用的缺陷，首次通过基因工程技术制备出可规模化生产的可分泌抗BCoV S1蛋白scFv的基因重组CHO细胞株，制备的scFv成本低廉，使特异性抗BCoV感染具备可行性。

3.本研究将为基因工程scFv药物在动物传染病防治领域提供新思路和宝贵经验。

技术路线、拟解决的问题及预期成果

1.抗BCoV S1蛋白重组scFv的真核表达

1.1 抗BCoV S1蛋白重组scFv基因SOE-PCR扩增：

培养分泌抗BCoV S1蛋白的阳性杂交瘤细胞，通过trizol法对其进行总RNA的提取，并测定浓度，鉴定纯度。再将提取的合格RNA样本反转录为cDNA。参考相关文献和NCBI基因库中收录的鼠源抗体序列，针对抗体可变区中相对保守的基因框架，分别设计轻链VL和重链VH的引物，并在引物两端修饰连接链Linker和酶切位点，便于拼接出单链抗体结构以及后续重组质粒的构建。

以合成的cDNA为模板进行轻链VL和重链VH的PCR扩增，将PCR产物进行核酸凝胶电泳，使用胶回收试剂盒回收目的基因条带，测定浓度和纯度。将重链VH和轻链VL基因通过重叠PCR（SOE-PCR）技术组装成含有酶切位点的全长scFv 基因。

1.2 pcDNA-S1-scFv真核表达载体的构建

参考相关文献，选择pcDNA3.1作为scFv基因的真核表达载体，并对其携带的启动子、抗性基因、标记基因、信号肽序列等元件进行设计，使之符合抗体蛋白瞬时表达和稳定表达的要求。其中瞬时表达载体以 CMV 为启动子表达外源基因，牛源的 Fc 片段用于稳定 scFv蛋白结构，稳定表达载体以 CAG 为启动子。将构建好的空载体质粒转入DH5α 感受态细胞中，涂布在含有抗生素的培养基平板上培养，挑取单菌落置于含有相同抗生素的液体培养基中培养，提取质粒。

对质粒和scFv 基因分别进行酶切处理，凝胶电泳观察酶切结果，胶回收含有质粒和scFv 的基因片段，使用连接酶进行酶连反应，制备出含有scFv 基因片段的重组质粒真核表达载体。将重组质粒再次转入DH5α 感受态细胞中，置于选择培养基中培养，挑取单菌落置于液体培养基中培养，提取质粒，酶切鉴定，测序分析质粒序列是否正确。

1.3 pcDNA-S1-scFv真核表达

培养CHO细胞，待其生长至合适的密度和状态时，加入转染试剂和构建好的重组质粒进行转染。之后继续培养到一定时间，收集细胞上清液，通过 Protein A 亲和层析柱法进行抗体蛋白的纯化。对样品进行 Western Blot 鉴定和 BCA 浓度定量。

2.抗BCoV S1蛋白重组scFv的生物学活性验证

2.1重组scFv的免疫检测效果评价

将原核表达的BCoV S1蛋白作为包被抗原，利用间接ELISA法验证scFv的抗原结合能力，以传统单克隆抗体为阳性对照，转染空载体的细胞上清为阴性对照，评价重组scFv的免疫检测效果。

2.2重组scFv的抗BCoV效果评价

在96孔板上培养HRT细胞，以200 TCID50/ml的的标准BCoV病毒液和等体积梯度稀释后的scFv抗体混合孵育，加入每孔细胞中，观察孔板中的病变效应，以检验scFv的抗体中和活性。传统单克隆抗体为阳性对照，转染空载体的细胞上清为阴性对照。评估重组scFv的病毒中和活性。

再利用BCoV小鼠攻毒模型，分别设置治疗组和对照组，治疗组再分别设置三个不同的scFv抗体浓度。在第0天对小鼠进行腹腔注射攻毒，攻毒剂量为3×10⁸TCID₅₀之后在第1-3天进行治疗组的scFv抗体治疗。

治疗后连续7天检测小鼠的存活率和体重变化，采集死亡小鼠组织，观察病理变化。利用RT-qPCR和免疫组化检测小鼠组织中的病原，HE染色检测组织学病变。结合小鼠死亡率和组织病理变化，评估scFv抗体的体内抗BCoV保护效果。

3.抗BCoV S1蛋白重组scFv的大规模生产工艺

3.1最佳真核表达载体的筛选

瞬时转染时，外源基因不会整合到宿主细胞基因组中，细胞能产生高水平表达的蛋白，但只能维持几天。而稳定表达能将外源基因整合到细胞的染色体 DNA 中，不会随着细胞分裂而导致外源基因丢失。

因此，根据相关文献研究，选择pcDNA3.1、pCOH-1两种真核表达载体，CAG、CMV、SV40三种启动子，用于驱动scFv基因在CHO细胞中的表达，筛选出最优真核表达载体。

3.2最佳表达细胞株的筛选

细胞系的稳定性对生物制药的生产具有重要意义。目前稳定细胞系要求CHO 细胞进行 60 次倍增周期后，细胞的蛋白表达水平维持在可接受范围内。CHO 细胞是工业生产蛋白类药物的首选宿主细胞，

首先选择CHO-K1、CHO-DG44和CHO-S这3种常见的细胞亚型进行筛选。在相同的培养条件下，比较转染前后不同细胞亚型的倍增速率、染色体突变和蛋白表达量差异，选择最优细胞亚型。

之后对CHO细胞进行悬浮培养驯化，简化细胞培养步骤，增加细胞的培养速度和生长密度，显著提高抗体蛋白产量。为了获得能够长期稳定表达scFv基因的CHO细胞系，构建载体时插入pac基因（编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶），再利用嘌呤霉素进行加压筛选。

3.3最佳培养工艺的筛选

血清的成分十分复杂，血清除含有促进生长的活性成分外，还含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响细胞功能的表达。血清复杂的成分也给基因工程表达产物的下游工作带来很大的困难，因此成分明确，价格经济的无血清培养基成为CHO细胞培养的一种必然需求。

使用无血清、化学成分明确的细胞培养基对CHO细胞进行驯化，先使用含血清的常规培养基和无血清培养基1:1悬浮培养细胞，培养至适当细胞密度。然后用等体积的无血清培养基将细胞稀释后继续培养，重复上述操作，直至血清浓度降为0.1％后，用完全无血清培养基培养，进行稳定传代。

使用搅拌式生物反应器对悬浮培养、无血清培养驯化成功的CHO细胞系进行培养，采用分批补料培养工艺，明确无血清培养基具体成分，便于更低成本的培养基配方和产品质量优化。

2.技术路线：

3.拟解决的问题：

3.1本研究拟解决犊牛BCoV感染性腹泻和呼吸道疾病无特效治疗制剂的难题，为解决犊牛腹泻，提高犊牛成活率提供技术保障。

3.2通过scFv制备生产工艺的优化，解决由于传统单克隆抗体制备工艺的缺陷，导致单克隆抗体不适合于动物疾病防治的缺陷，实现scFv药物在动物传染病防治领域应用。

4.预期成果

4.1利用真核表达系统成功制备出具反应原性、抗病毒等生物学活性的抗BCoV S1蛋白重组scFv。

4.2制备出可大量表达抗BCoV S1蛋白重组scFv的重组CHO细胞株，以及工厂化生产重组scFv的生产工艺。

4.3定制出应用scFv预防与治疗BCoV的技术方案。

4.发表核心期刊论文1篇。

5.培养本科生5人

项目研究进度安排

2024年7月-2025年12月

（1）查阅文献，准备实验材料。

（2）设计并合成扩增引物，拼接scFv全长基因片段。

（2）构建真核表达载体，制备重组质粒。

（3）将重组质粒转入CHO细胞，制备scFv。

（4）scFv的功能活性验证和抗病毒保护实验。

2025年1月-2025年7月

（1）优化scFv的大规模生产工艺。

（2）scFv的临床应用。

（3）分析整理研究结果，撰写论文，申请专利。

（4）准备结题材料。