PEDV、TGEV和PoRV三重RT-PCR检测方法的建立及应用

PEDV、TGEV、PoRV是临床上引起仔猪腹泻病的3种主要病毒。这三种病毒持续危害着整个养猪业，给我国造成了严重的经济损失。由于3种病毒的临床症状和病理变化非常相似，仅靠临床诊断很难区分病原，需要借助实验室方法检测。PEDV目前存在经典毒株与变异毒株，现如今PEDV经典疫苗株作为弱毒疫苗被广泛使用。PEDV经典疫苗株ORF3基因较强毒株存在缺失，利用二者区别设计引物，特异性扩增强毒ORF3基因保守序列而不扩增弱毒ORF3基因保守序列，可区别经典疫苗株，避免养殖户对PEDV感染情况作出错误判断。基于此，本研究根据拟建立的PEDV、TGEV和PoRV三重RT-PCR方法，可以准确的检测PEDV、TGEV和PoRV三种病毒并在此基础之上区分PEDV经典疫苗株。

1. 单重RT-PCR方法的建立

1.1 引物合成与验证

利用mega 7.0.26比对NCBI上公布的PEDV、TGEV和PoRV流行毒株基因序列，利用primer 5.0根据其保守区域设计特异性引物。提取PEDV经典强毒株CV777、及其致弱毒株、TGEV弱毒华株、PoRV NX株病毒核酸，反转录为cDNA，作为模板验证引物效果。

1.2 标准品制备

根据引物扩增基因，由上海生工生物工程公司合成标准质粒。

1.3 反应条件优化

根据引物Tm值设置梯度退火温度，设置梯度引物浓度、梯度循环数和反应酶添加量，对标准质粒进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳进行验证，选择最亮条带的反应条件作为三重RT-PCR条件参考。

2. 三重RT-PCR方法的建立与评价

2.1 反应条件优化

等比例混合PEDV、TGEV和PoRV标准质粒，通过RT-PCR优化反应条件，具体优化模式参考1.3，明确三重RT-PCR最佳反应条件。

2.2 敏感性

等比例混合PEDV、TGEV和PoRV标准质粒，10倍梯度稀释混合的标准质粒，利用建立的三重RT-PCR检测方法检测每一个稀释倍数的混合质粒，取三种病毒核酸条带均能清晰辨认的质粒浓度为该方法最低检出限。

2.3 特异性

利用建立的三重RT-PCR检测方法同时检测PEDV、TGEV、PoRV、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、经典猪瘟病毒和猪圆环病毒2型等导致猪腹泻的病毒。

2.4 稳定性

利用建立的三重RT-PCR检测方法重复多次检测同一标准质粒和阴性样本，确定方法的稳定性。

3. 临床检测

3.1 样品采集与检测

采集1-10日龄腹泻仔猪新鲜粪便，经PBS涡旋震荡重悬，离心后取上清液，提取总RNA并反转录为cDNA。利用建立的三重RT-PCR检测方法对cDNA进行检测，确认样本中PEDV、TGEV和PoRV阳性率。

3.2 符合性试验

利用建立的三重RT-PCR检测方法分别与权威单重RT-PCR检测方法以及其他PEDV、TGEV和PoRV三重检测方法检测临床阳性和阴性样本，进行对比。扩增差异条带并测序，验证差异结果，明确检测方法符合性。

猪流行性腹泻的病原为PEDV，为单链正义RNA病毒，隶属于冠状病毒，α科冠状病毒属^[1]，主要通过消化道感染猪肠道，导致仔猪腹泻、脱水和死亡，也可感染成年猪导致腹泻，死亡率可达100%^[2]。PEDV于1971年在英国被发现，随后陆续在欧洲各国流行并迅速传至世界各地^[3]。1980年，PEDV首次传入中国。2010年，由于PEDV变异毒株的出现导致了中国大量仔猪的死亡^[4]。由此，PEDV被分为GⅠ型经典毒株和GⅡ型变异毒株^[2]。由于PEDV经典弱毒株作为疫苗被广泛应用，但其不能预防PEDV变异毒株的感染，无法区分PEDV经典疫苗株和变异株导致难以正确判断疫情。

猪传染性胃肠炎的病原为TGEV，为单链正义RNA病毒，隶属于冠状病毒科，α冠状病毒属^[5]。主要通过粪口传播感染仔猪，可导致仔猪出现呕吐、腹泻和严重脱水^[6]。 TGEV自1946年在美国被报道，之后陆续传播至欧洲和亚洲^[7]。TGEV N基因保守性高且蛋白含量最为丰富^[8]，适合作为RT-PCR检测靶标。根据TGEV N基因设计的PCR检测引物应具有较好的保守性。

PoRV为分节段的双链RNA病毒，隶属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属^[9]。各年龄段的猪均可感染该病毒，主要症状为水样腹泻、呕吐等，尤其是仔猪感染症状最严重，虽然死亡率较其他两种病原低，但发病率高达100%，严重影响仔猪生长性能^[10]。1975年首次在猪体内发现轮状病毒，随后PoRV在世界各地广泛流行。轮状病毒基因组包含11个节段，分别编码6个结构蛋白和5个非结构蛋白^[11]。，其基因组由11个独立片段的双股正链RNA组成 ，共编码６种结构蛋白 （VP1～VP4、VP6和 VP7）和６种非结构蛋白 （NSP1～NSP6），其中第11节段编码 NSP5和 NSP6两种非结构蛋白^[12]。其根据VP6氨基酸序列差异可划分为A~J 10个群，其中A、B、C和H群与仔猪腹泻密切相关，其中A群轮状病毒（RVA）的致病性相对较高且流行最广，而轮状病毒VP6基因高度保守^[13]，适合作为RT-PCR检测靶标。这三种病毒在中国大量流行，严重影响生猪养殖业的发展。

PCR检测方法以其高敏感性、特异性和稳定性，被广泛运用于分子生物学检测一线。国内目前存在多种同时检测PEDV、TGEV和PoRV的多重PCR检测方法，李儒曙^[14]等建立了基于Taq Man探针的PEDV、TGEV、PoRV三重RT?PCR检测方法，但是样本检测成本高，且以PEDV N基因为检测靶标难以区分经典疫苗株。蒲翠敏^[15]等建立了PEDV、TGEV和PoRV三重PCR检测方法，分别靶向PEDV S基因、TGEV M基因和PoRV VP7基因，但是由于PEDV S基因和PoRV VP7基因易突变，容易导致检测结果假阴性。同时也缺少区别PEDV 经典疫苗株的能力。综上，需要研发一种适合基层检测、检测结果稳定，同时具备一定PEDV经典疫苗株分辨能力的多重PCR检测方法。

参考文献：

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[15] 蒲翠敏, 冯旭芳, 张双翔, 等.PEDV、TGEV和PoRV三重PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 动物医学进展, 2018, 39(02):19-25.

本项目创新点和特色之处在于靶向PEDV、TGEV和PoRV 保守基因设计特异性引物，可特异性识别样本中PEDV、TGEV和PoRV，并且由于PEDV检测引物的设计基于PEDV强毒株与经典疫苗株ORF3基因差异序列，可特异性检测PEDV强毒株却不扩增经典疫苗株ORF3序列，可鉴别PEDV经典疫苗株。

技术路线

技术路线

拟解决问题

建立PEDV、TGEV和PoRV三重RT-PCR检测方法，同时完成样本PEDV、TGEV和PoRV病原检测，区分PEDV经典疫苗株。

预期成果

1. 完成建立PEDV、TGEV和PoRV三重RT-PCR方法，产品可以临床用于检测PEDV、TGEV和PoRV三种病毒并在此基础之上区分PEDV经典疫苗株。

2. 发表论文一篇或申请专利一项。

3. 参加竞赛一项。

2024年 09月～2024 年12月：完成实验设计，准备实验试剂。

2025年 01月～2025年09月：优化RT-PCR反应条件，尽可能多的临床检测样本，整理实验记录。

2025年10月～2025年12月：撰写文章和结题报告。