水稻萜烯合成酶基因（TPS）家族鉴定及在温汤浸种萌发中的功能分析

水稻是主要的粮食作物之一，2022年全国水稻种植面积2 945.0万hm²，发展等综合影响，2022年我国水稻单产7 080.0 kg/hm²，总产20 849.5万t。2023年“中央一号文件”提出全力抓好粮食生产，稳面积、主攻单产和力争多增产的目标。目前栽培种在水稻播种前多采用种子包衣的处理方式，包衣可使水稻防病、防虫和促进种子茁壮成长及增产增收的目的，但种子包衣成本较高，且包衣的化学药剂易破坏生态环境。故采用有机栽培种子消毒的最佳方式--温汤浸种，智能机械调控60℃的水、温汤浸种10分钟，为了杀死潜伏在种子表面和内部的恶苗病、稻瘟病等病害病株，达到安全环保，降低成本的目的。植物中的萜类化合物发挥重要的作用，可直接或间接对植物生长发育中的病原微生物进行防御，也可以对植食性昆虫产生生物胁迫及在高温和干旱等逆境的非生物胁迫，萜烯合成酶基因在调控作物生长发育，生物胁迫和抗逆境胁迫防治等方面具有广阔的前景，是植物生物合成萜烯挥发物的关键基因。植物TPS家族可以参与各种植物抗逆性生理过程。植物TPS基因家族基因数量在20-150个左右，涉及多个方面的抗逆性状，但是，在水稻研究领域中，TPS基因功能仅限于对水稻抗褐飞虱的研究，对水稻TPS基因家族分析和基因表达模式的研究具有理论意义。本研究通过对水稻TPS基因家族的鉴定分析，结合水稻温汤浸种处理，明确TPS基因在水稻温汤浸种萌发中的调控功能，最终实现水稻种子不包衣，达到苗齐、苗壮、高效、环保的目标，同时也为水稻抗逆分子育种提供重要基因资源。

 1、水稻温汤浸种萌发方式筛选

采用建三江农场主栽水稻品种龙粳31，设置2个温汤浸种，1个种衣剂包衣和1个不温汤不包衣共4个试验处理，对水稻种子破胸率、发芽势、发芽率，水稻垩苗病防病效果，出苗和秧苗素质等指标进行对比和筛选。

2、TPS家族基因生物信息学分析

在Esmble网站(https://www.esmble.org/)下载水稻参考基因组及注释文件，TPS的隐马尔科夫模型文件(PF01397和PF03936)自Interpro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)下载，利用Tbtools软件进行TPS蛋白的全部成员检索，在SMART (http://smart. emblheidelberg.de) 数据库对候选基因进行保守结构域的验证。利用Tbtools软件分析水稻TPS基因的结构，在染色体上的位置以及启动子功能预测，并利用DNAMAN软件对水稻、拟南芥TPS基因的氨基酸序列进行多重比对, 比对结果用MEGA5 (http://megasofitware.net) 进行系统进化分析。

3、水稻TPS基因表达模式分析及目标基因筛选

分别提取水稻种子、幼苗、叶片和根系中的RNA,分别设计水稻TPS家族基因的引物，以水稻基因OsACTIN为内参基因，进行荧光定量PCR反应，分析TPS基因在水稻不同组织和不同萌发方式中的表达模式。同时筛选与种子萌发相关基因，对筛选基因进行功能预测和分析。

4、水稻TPS基因在温汤浸种萌发中的作用机制解析

将步骤3筛选出来的与水稻发芽性状相关基因构建OsTPS基因超量表达载体（P1300-OsTPS）和RNAi表达载体（PHB121-OsTPSRNAi）并转化水稻品种；转化植株不同萌发条件下验证其对种子萌发的影响，通过荧光定量 PCR对OsTPS基因进行表达分析，从而解析OsTPS对水稻温汤浸种后种子萌发的作用机制。

1、水稻温汤浸种方面

黑龙江省是全国最大的粳稻生产基地和重要的商品粮基地，为国家粮食安全和地方经济发展做出了巨大贡献。黑龙江省水稻栽培经历了从直播到浸种育秧移栽的发展历程,种子包衣浸种育苗-然后插秧两段式栽培为寒地水稻高产稳产做出了巨大贡献,仍是目前水稻栽培的基本方式。然而,水稻种子包衣浸种育苗存在如下主要问题:1.种子包衣浸种催芽进行种子消毒产生大量的有毒有害的液体污染环境，不利于水稻的有机、绿色栽培；2.种子包衣、浸种催芽环节多,费工费力，不利于低成本稻作。日本在水稻温汤浸种方面的应用早已普及，方法是种子不包衣,采用智能机械调控60℃的水、温汤浸种10分钟，以杀死潜伏在种子表面和内部的恶苗病、稻瘟病等病害病株，水稻温汤浸种具有环保、省工省力、利于有机绿色栽培的特点，是一种简单、经济有效的种子消毒方法，是有机栽培种子消毒的最佳方式。

2、萜烯合成酶基因研究方面

萜类化合物是一类种类最多的自然界植物次生代谢产物。随着大多数植物全基因组测序的完成，已成功在多个物种中进行了萜烯合成酶基因（TPS）的基因组水平鉴定。成功克隆出的模式植物中的萜烯合成酶基因包括拟南芥、水稻和玉米等。随着基因组学、分子生物学和基因编辑技术的发展，现在有可能对萜烯合成酶基因进行编辑。通过编辑这些基因，可以改良作物的一些数量性状，例如提高作物的授粉效果和果实品质，增强作物的抗病性和抗虫能力等。这为进一步改善农作物的特性和质量提供了新的途径。另外，对于萜烯合成酶的生理和生态功能也可以进行验证，并对萜类化合物的合成和调控进行基础研究。最近的研究已经表明，在将三种利马豆中的萜烯合成酶成功转化到水稻中之后，水稻能够通过吸引雌性二化螟绒茧蜂-稻纵卷叶螟的天敌来增加自身的天敌防御能力。这个发现显示了编辑萜烯合成酶基因在农作物中可能具有的潜在应用价值。挥发性萜类化合物的释放可以赋予水果和鲜花芳香特性。研究发现，通过大量积累转基因番茄植株中的S-芳樟醇，可以增加成熟果实的香味并提高水果的品质。此外，还有研究表明，在水稻中进行了 TPS46 基因的RNA干扰处理后，柠檬烯和(E)-β-farnesene含量显著降低，而在过表达的品系中柠檬烯和(E)-β-farnesene含量明显增加。这种调控使得水稻能够通过产生更多的柠檬烯和(E)-β-farnesene来排斥蚜虫，从而增强了水稻的抗虫能力，并提高了其抗逆性。

水稻基因组测序的结果为研究水稻萜类化合物的生物合成和功能鉴定提供了理论基础。试验发现了50个萜烯合成酶基因，但目前对水稻萜烯合成酶功能的报道较少。特别是与水稻温汤浸种和萌发过程相关的萜烯合成酶的表达和功能特性还需要进一步研究。TPS基因家族分析和基因表达模式的研究对于理解水稻抗逆机制具有重要意义，并且为现代水稻抗逆性状的分子育种提供了重要的基因资源。因此，深入研究水稻萜烯合成酶基因及其在抗逆性状中的作用对于水稻品和增强抗逆能力具有重要的理论和实际意义。

 本研究以水稻温汤浸种，以杀死潜伏在种子表面和内部的恶苗病、稻瘟病等病害，达到安全环保栽培为背景，对水稻萜烯合成酶基因（TPS）家族进行鉴定，并进行功能分析。

1、创新研究萜烯合成酶基因（TPS）对水稻温汤浸种的作用

关于拟南芥、玉米等作物中TPS的功能已有报道，但水稻TPS的相关报道非常有限，本研究将注意力集中于OsTPS，研究其对水稻温汤浸种后种子萌发中的作用。

2、揭示萜烯合成酶基因（TPS）调控水稻温汤浸种的分子机制

目前尚未有研究报道OsTPS如何调控水稻种子萌发形成过程。本项目拟通过荧光定量 PCR对OsTPS基因进行表达分析，揭示OsTPS基因调控水稻温汤浸种后种子萌发形成的分子机制，具有明显的理论创新。

技术路线:

拟解决的问题:

1、TPS基因参与植物抗逆性生理过程，TPS对水稻种子萌发是否具有积极作用，本研究构建OsTPS基因RNAi表达载体及超量表达载体并转化水稻，验证其在温汤浸种萌发中所起的作用。

2、OsTPS是如何调控温汤浸种后种子萌发的，其作用机制是什么，本研究通过水稻OsTPS基因表达模式探究，结合种子温汤浸种萌发方式筛选，明确与水稻温汤浸种萌发相关信号途径，从而揭示OsTPS基因表达模式。

预期成果:

1、鉴定OsTPS基因对温汤浸种萌发的生物学功能；

2、揭示OsTPS基因调控温汤浸种萌发的分子机制；

3、核心期刊发表论文1篇；

4、形成研究报告1份。

2023.8-2023.10

TPS基因生物信息学分析及功能预测；构建基因沉默载体和超量表达载体分别转化水稻。

2023.11-2023.12

水稻温汤浸种萌发方式筛选；水稻TPS基因表达模式分析及目标基因筛选。

2024.1-2024.6

水稻TPS基因在温汤浸种萌发中的作用机制解析；撰写、发表研究论文。

2024.6-2024.7

整理数据；撰写结题报告。