Prx V对苦木提取物诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的调控作用及机制研究

肿瘤与癌症因极高的致死率和极低的治愈率严重危害人类的生命安全，宫颈癌更是在威胁着全球女性的生命健康，SiHa细胞是人子宫颈的复层鳞状上皮的肿瘤细胞。研究表明，肿瘤细胞会产生较高水平的ROS，ROS水平升高会诱导细胞凋亡，PQ作为抗肿瘤药物能引起细胞内活性氧的增高。研究证实Prx V作为信号转导调节因子，具有清除细胞内ROS的作用，但Prx V对苦木诱导SiHa细胞凋亡过程中的调控机制尚不明确。因此本项目的研究目的是明确PQ治疗宫颈癌的分子机制以及Prx V对PQ诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡过程的调控作用。

本研究预计提取PQ，并通过MTT法检测PQ对SiHa人宫颈癌细胞是否具有药物毒性；通过荧光显微镜检测PQ处理后，细胞的存活情况和细胞内ROS变化情况；并通过Western blot检测PQ对SiHa细胞细胞内Prx V的蛋白表达水平的影响。随后，通过加入细胞内ROS抑制剂（N-乙酰半胱氨酸，NAC），证明了Prx V在PQ诱导SiHa细胞凋亡过程中具有作用。最后，利用慢病毒载体构建Mock和Prx V过表达的SiHa细胞系，利用PQ进行处理，采用MTT实验、划痕实验、集落形成实验、荧光显微照相技术和蛋白质免疫印迹法对其进行细胞活力测定；细胞迁移能力和增殖能力检测；线粒体损伤及细胞凋亡有关的蛋白质在ROS水平的变化。探究PQ诱导SiHa人宫颈癌细胞凋亡过程中，Prx V在其中的调控作用及其机制。

1.宫颈癌的治疗现状

宫颈癌（cervical cancer）是一种常见的妇科疾病，位居女性恶性肿瘤发病率和死亡率的前列，我国每年新增宫颈癌病例约14万，死亡患者人数约为3.7万^[1,2]。我国是全世界宫颈癌患病率排名第2的国家，且在新疆、内蒙、山西、陕西等地死亡率较高^[3]。如今高危型HPV16、HPV18感染被视为宫颈癌发病的首要因素，此外，性生活混乱、抽烟、免疫反应等也有可能导致宫颈癌病变 ^[3,4]。宫颈癌病变是从宫颈上皮内瘤变到早期浸润癌再到浸润癌的过程，由于我国宫颈癌筛查工作还未完全完善，因此有80%的宫颈癌患者确诊时已是浸润癌^[5]。宫颈癌除了本身会导致患者生理功能受损，还易引起患者的心理疾病，大部分宫颈癌患者生存质量不容乐观^[6]。由于临床上用于宫颈癌治疗的一线化疗药物，如：氟尿嘧啶、顺铂、博来霉素等效果并不理想，且存在较多不良反应，易产生耐药性^[7]。这些化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也会对正常细胞产生损伤，因此患者会出现一系列毒副反应如:恶心呕吐、肝肾功能损害、骨髓抑制、神经毒性、耳毒性、皮肤黏 膜损害、过敏反应等一系列毒副反应。因此，寻找高效、低毒、低成本的新型抗宫颈癌药物变得尤为重要。近年来，随着实验技术的开发与应用，使得中医药研究也得以发展，中医药抗癌是目前关注的热点之一^[8-10]。天然药物成分多较复杂^[11]，可能含一种或多种有效成分，其抗癌作用可能是单独作用，或是协同起作用，因此相关领域研究工作者也在不断探索中医药在宫颈癌防治过程中的作用途径及机制，主要集中在抑制细胞的增殖，诱导细胞发生凋亡；阻滞细胞周期，调节基因表达；抑制细胞侵袭，防止转移，以及细胞自噬等方面^[12]。

目前，宫颈癌治疗方法主要有手术、放疗、化疗和靶向疗法等^[13]。但子宫切除手术会损伤神经，可能会导致膀胱功能受损、性功能障碍等并发症^[14]。放化疗可能引起肠道功能损伤、卵巢功能丧失等不良反应^[15]。因此大量的研究开始趋向于肿瘤的分子靶向性治疗。宫颈癌大约85%的组织学类型为鳞状细胞癌^[16]，人宫颈鳞癌SiHa细胞系用于肿瘤的研究已有三十多年历史，是合适的实验对象^[17]。宫颈癌现已严重威胁女性生命健康，早期发现并找到有效专一的治疗手段迫在眉睫，有研究表明，过氧化物还原酶家族（Peroxiredoxins,Prxs）在减少放疗和化疗的抗药性^[18]、诱导细胞增殖^[19]、增加细胞分化能力^[20]、调控细胞凋亡^[21]等方面发挥重要的调控作用。其中过氧化物还原酶V（Peroxiredoxin，Prx V）在各种癌症的调往过程中已有广泛的研究，但在宫颈癌调往过程的研究尚不明确。

所以靶向Prx V可能为PQ成功治疗宫颈癌提供新的思路。

2.苦木的抗癌疗效现状分析

苦木（Picrasma quassioides (D.Don) Benn，PQ）在临床上是一种重要的中医药，在我国资源丰富，主产于黄河流域及其以南各省区，其中广东、广西资源较多，其化学成分主要为生物碱、苦木苦味素和萜类，其次为挥发油、甾醇、香豆素、皂苷、醌类等，具有抗菌、抗炎、抗肿瘤等生物活性，它的特性已受到广泛的关注^[22-24]。Shinsaku^[25]等人研究发现，苦木具有良好的抗癌疗效。苦木中的化合物苦木素苷 A,黄苦木素 B及 苦木素苷 B对白血病细胞P388具有抑制作用，并且黄苦木素 B和苦木素苷 A的抑制活性都比阳性对照药5-氟尿嘧啶强；Chen^[26]等人研究表明，苦木中的β-咔巴琳生物碱对烟草花叶病毒有一定的抑制作用，并且当这些生物碱与苦木内脂等药物进行联合应用时出现的抑制效果更加显著。刘岩^[27]等人利用 MTT比色法检测不同浓度苦木提取物在不同的时间对HepG2人肝癌细胞的生长抑制作用，证明苦木醇提物能有效抑制HepG2细胞的生长，并且对肝癌细胞凋亡有显著的诱导作用。由于从众多传统医药的提取物中发现了活性氧（ Reactive Oxygen Species，ROS）参与化学预防和抗肿瘤的作用^[28]。有研究发现，苦木提取物可以通过增加细胞和线粒体内ROS水平来诱导细胞凋亡，发挥抗癌作用^[29]。

3. Prx V与细胞凋亡之间的相互联系

Prxs是细胞内的抗氧化物酶，具有清除肿瘤细胞内ROS的功能^[30]。ROS浓度较高时可以诱导细胞凋亡，而ROS还可以通过DNA损伤时所导致的线粒体功能损伤参与肿瘤细胞的形成，所以提高细胞中ROS的含量可以诱导细胞凋亡^[31]。有研究表明Prxs家族蛋白对信号传导以及肿瘤细胞的增殖、迁移、凋亡等过程均发挥着重要作用，所以保护肿瘤基因组的稳定可以视为Prxs家族蛋白对肿瘤预防的重要特征^[32,33]。目前Prxs家族中已有关于Prx III在调控ROS水平抑制宫颈癌细胞凋亡过程中发挥重大作用的研究^[34]。Prx V是Prxs家族中的第五位成员，被称为非典型2-Cys过氧化物还原酶，主要存在于线粒体等细胞器中,具有清除细胞内ROS的功能，保护了细胞从而减轻细胞发生凋亡^[32,35,36]。有研究表明，Prx V蛋白水平在HepG2肝癌细胞、SW480结肠腺癌细胞、AGS胃腺癌细胞中均有变化，在肝癌细胞中，过量表达Prx V能够抑制细胞凋亡；在胃癌细胞中，过量表达Prx V能够促进细胞增殖；在结肠腺癌细胞中，过量表达Prx V能够增加细胞的迁移率和侵袭性；在异种移植小鼠模型中，过量表达Prx V能增快细胞的生长^[35,37,38]。

本研究利用Prx V（实验组）和Mock (对照组)SiHa人宫颈癌细胞，研究Prx V对苦木提取物诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的调控作用及其机制研究。

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研究显示，与正常细胞相比对应的肿瘤细胞会产生更高水平的ROS，ROS在肿瘤的发生发展过程中具有重要的调控作用。Prx V是Prxs的一员，具有清除细胞内ROS，抑制氧化应激诱导细胞凋亡的功能。本项目为PQ治疗宫颈癌应用提供有效的理论依据，为阐明Prx V在宫颈癌靶向性治疗过程中提供新的视野，进一步为Prx V相关功能提供理论依据。

本项目的创新点是首次探究在苦木提取物诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的调控作用及其机制中Prx V所扮演的角色，为宫颈癌的治疗提供新的方向。

技术路线：

拟解决的问题:

本项目在Prx V对苦木提取物诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的调控作用及其机制研究过程中，拟解决的关键问题是：

1. 苦木提取物如何诱导SiHa细胞凋亡；

2. Prx V在苦木提取物诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡的调控机制，这是本项目研究的重点也是难点；这一关键问题的解决可以为Prx V靶向性治疗宫颈癌的调控作用提供新的视野。

研究成果：

结果一 PQ通对SiHa细胞内ROS水平及细胞凋亡的影响

为了检测苦木提取物对SiHa人宫颈癌细胞药物毒性，我们用不同浓度（0、40、60、80 μg/mL）处理SiHa细胞24 h，利用MTT法检测结果显示当苦木提取物处理细胞的浓度不断地的增加时，SiHa细胞存活率不断地下降（图1A）。为了验证苦木提取物是否通过诱导细胞凋亡使SiHa细胞存活率降低，我们分别以0、40、60 μg/mL的苦木提取物浓度处理细胞24 h，流式细胞术检测结果显示随着药物浓度的不断升高，Annexin V发出的绿色荧光和PI发出的红色荧光强度显著增加，细胞凋亡加剧（图1B和1C）。为了验证苦木提取物是否会提高细胞内的活性氧水平，我们用流式细胞仪的检测结果显示，40 μg/mL浓度的PQ对SiHa细胞处理24 h后ROS水平明显高于Con组（图1D）。

图1. PQ通对SiHa细胞内ROS水平及细胞凋亡的影响。

结果二 PQ对SiHa细胞Prx V表达水平的影响及Prx V过表达细胞系构建

为了验证Prx V在苦木提取物诱导SiHa细胞凋亡过程中具有作用，检测了细胞内Prx V蛋白表达含量，结果显示苦木提取物处理后，Prx V蛋白表达水平明显降低（图2A和图2B）。为进一步证明细胞内ROS水平的升高能降低Prx V蛋白表达水平，我们提前30 min在SiHa细胞中加入了NAC，然后与40 μg/mL的苦木提取物共同处理24 h后，结果可知，与对照组相比，处理组细胞内的Prx V蛋白表达水平下降，但是加入NAC后，Prx V蛋白表达水平显著上升（图2C和图2D），证明了Prx V在苦木提取物诱导SiHa细胞凋亡过程中具有作用。

为了探究Prx V是如何调控苦木提取物诱导SiHa细胞凋亡的，我们采用慢病毒技术对SiHa细胞进行了转染, Prx V基因过量表达和空载体的SiHa细胞系构建后分别命名为O/V和Mock两组。蛋白免疫印迹法鉴定结果表明,SiHa细胞内Prx V基因过量表达组已带有转入的His标签, 说明构建成功(图2E和2F)。

 图2. PQ通对SiHa细胞内ROS水平及细胞凋亡的影响。 

结果三 过表达Prx V减弱PQ对SiHa细胞活力、迁移及集落形成能力的影响

利用不同浓度(0、40、60、80 μg/mL)的苦木提取物处理SiHa细胞24 h,利用MTT 法检测细胞存活率。结果表明, 在Prx V过表达后SiHa细胞的存活率明显高于Mock组，并具有显著性差异(图3A)。

为了检测Prx V基因过量表达对SiHa细胞迁移能力的影响，我们利用0 μg/mL和40 μg/mL的苦木提取物处理构建成功的Mock组和O/V组SiHa细胞48 h，通过划痕实验和群落形成实验分别检测Prx V基因的过量表达对细胞迁移能力和群落形成能力的影响；结果显示,O/V组SiHa细胞迁移速率快于Mock组；同时SiHa细胞群落形成的能力O/V组高于Mock组(图3B、C和D)。

  图3. 过表达Prx V减弱PQ对SiHa细胞活力、迁移及集落形成能力的影响。

结果四 过表达PrxV抑制PQ对SiHa细胞内ROS及线粒体损伤的影响

为了检测Prx V的过量表达对PQ诱导的SiHa细胞内ROS水平的影响, 利用ROS标记试剂DHE进行标记，荧光显微镜照相结果显示,40 μg/mL的PQ处理后O/V组细胞内ROS水平低于Mock组(图4A)。接着,为了检测Prx V的过量表达对PQ诱导的SiHa细胞线粒体内ROS水平的影响,利用线粒体ROS标记试剂Mito SOX进行标记,荧光显微镜照相结果表明,40 μg/mL的PQ处理24h后O/V组细胞内ROS水平低于Mock组(图4B)。接下来为了检测Prx V基因过量表达对苦木提取物诱导的SiHa细胞线粒体损伤的影响,利用线粒体膜电位标记试剂JC-1进行标记，荧光显微镜照相结果显示,40μg/mL的PQ处理24h后O/V组细胞内线粒体膜电位水平高于Mock组(图4C)。最后为了检测Prx V基因过量表达对PQ诱导的SiHa细胞存活率的影响，利用活细胞荧光染料钙黄绿素进行标记,荧光显微镜照相结果显示,40μg/mL的PQ处理24h后的O/V组细胞存活率高于Mock组(图4D)。

图4. 过表达PrxV抑制PQ对SiHa细胞内ROS及线粒体损伤的影响。

预期成果:

1. 阐明苦木提取物诱导宫颈癌SiHa细胞凋亡过程中Prx V的调控作用，为宫颈癌的治疗提供理论依据。

2. 参加1-2项比赛。

3. 发表一篇核心及以上期刊。

1. 2020.09-2020.10对SiHa细胞内ROS水平及细胞凋亡的影响

2. 2020.11-2020.12对SiHa细胞Prx V表达水平的影响及Prx V过表达细胞系构建

3. 2021.03-2021.04过表达Prx V减弱PQ对SiHa细胞活力、迁移及集落形成能力的影响

4. 2021.05-2021.08过表达PrxV抑制PQ对SiHa细胞内ROS及线粒体损伤的影响

5. 2021.09-2021.12过表达PrxV抑制PQ对SiHa细胞凋亡蛋白的影响

6. 2021.09 -2022.04整理数据，撰写论文

7. 2022.01-2022.04参加“黑龙江省大学生创新创业大赛”

8.2022.05-2022.12准备结题材料，进行结题