一种功能性双菌双蛋白酸乳酪的开发与研究

随着经济的快速发展以及生活水平的不断提高，人们越来越关注生活品质和自身健康，对食品的营养也提出了更高更科学的要求。大豆作为黑龙江省广泛种植的农作物之一，来源广泛，蛋白质含量是现有农作物中最高的，氨基酸组成也较为全面，是一种质优价廉的蛋白质来源。牛奶中含有人体所需的全部营养物质，氨基酸种类丰富，但相对来说价格较高。相较于大豆蛋白，牛乳蛋白更易于吸收，但也有不足之处，如伴有动物性脂肪（多为饱和脂肪酸）和胆固醇，长期过量进食，易使人血管粥样硬化、血压升高、诱发脑溢血和心肌梗塞等疾病。而大豆蛋白的摄取则常伴有大豆异黄酮、维生素、矿物质、膳食纤维和多不饱和脂肪酸等有益成分的摄入。此外，牛乳蛋白富含蛋氨酸，可以补充大豆蛋白质中蛋氨酸的不足。因此，动、植物蛋白搭配，不仅可使氨基酸的配比更合理，还能增进有益营养成分的摄取，从而更利于人体健康。然而目前我国城镇居民以牛奶为主的动物蛋白摄入增多，优质植物蛋白摄入不足，而部分农村地区则正好相反，存在结构性失衡问题。将大豆蛋白和牛乳蛋白结合，实行双蛋白的开发是强化动植物蛋白互补作用的有效途径，同时有利于我国城乡居民膳食营养结构的优化。

乳酸菌是公认的食品安全性菌株。作为人体重要的益生菌类群，在发酵食品工业中应用广泛。豆乳和牛乳是乳酸菌生长的良好基质，经发酵可进一步提升其营养价值和健康效应。目前，各式各样的乳酸菌发酵酸牛奶已占据各大市场，并获得大众认可和喜爱，而发酵豆乳却因存在质地（粗糙、易碎、不细腻）和风味不佳（豆腥味及泡菜味较重）的技术难题，严重限制了产品的生产和消费。

针对以上问题，本申请项目以豆乳和牛乳为混合发酵基质，利用自行分离的植物源高产胞外多糖乳酸菌菌株——保加利亚乳杆菌H-3进行豆乳发酵和产品质地改良，酸奶生产菌嗜热链球菌ST3进行牛乳发酵和产品风味改善，同时添加谷氨酰胺转氨酶（TG酶）协同凝胶，从而开发一款感官品质良好，富含活性乳酸菌的新型酸乳酪产品，实现动植物蛋白优势互补与乳酸菌益生特性的完美结合。该项目的实施可以为功能性动植物双蛋白食品的开发提供新的思路和研究方向。

1. 双菌双蛋白酸乳酪发酵工艺优化。以感官评价为指标，利用单因素和正交试验对酸乳酪的发酵工艺进行优化，建立最优化发酵工艺条件；

2. 产品的理化性质及功能活性研究。即对产品的粗蛋白、粗脂肪、灰分、粘度、风味等理化性质，以及胞外多糖、10 kDa以下肽等功能成分含量和抗氧化及ACE抑制活性进行测定与分析；

3. 产品的贮藏期分析。即对贮存期间产品的酸度、感官特性、乳酸菌活菌数、粘度、食品安全微生物指标等品质指标进行分析，得出该产品在4℃条件下的保臧期。

牛奶和豆乳在营养价值上，各有优势和不足。豆乳蛋白质含量与牛奶相当，易于消化吸收，也不含胆固醇且没有乳糖不耐反应，但豆乳中总钙、维生素C等物质的含量低于牛奶。牛乳中饱和脂肪酸含量相对较高，对于“三高”人群、老年人及心血管疾病患者不利且我国居民中有相当一部分存在乳糖不耐反应，并且牛奶价格相对较高，现阶段广大农村居民难以承受。此外，豆乳还含有多种功能性营养成分，如大豆皂苷、植物固醇、大豆异黄酮等，但Zn、Sn、VA、B族维生素等含量低于牛奶^[1]。因此将豆乳和牛乳结合利用，既可以降低消费成本，还可以实现双蛋白的营养互补。国民营养计划也提出在全民中推广以“优质植物蛋白质为主，优质动物蛋白为辅”的优质双蛋白食品。因此，大力开发双蛋白食品是基于国情的必由之路。然而，目前市场上双蛋白类产品种类较少，还不能满足群众对健康和营养的消费需求。

目前，国内外在双蛋白奶制品方面的研究已经取得了较大的进展。国内针对双蛋白产品的开发与研究逐渐增多。吴祖兴^[2]通过双蛋白概念的提出，概述了大豆牛奶双蛋白奶国内外的发展现状及进展，并对大豆牛奶双蛋白奶的营养价值进行了详细阐述；罗薇等^[3]阐述了大豆分离蛋白在乳制品中应用的可行性，并介绍了大豆分离蛋白在奶粉、酸奶、冰淇淋、液态奶和乳饮料等产品中应用的现状；魏亚歌^[4]以纯牛乳和大豆蛋白组成的混合乳为基质，从6株乳酸菌中筛选出了两株适宜于双蛋白干酪生产的菌株，并对双蛋白干酪加工品质及成熟期理化指标等进行了详细研究；刘安让^[5]对菌种的选择和发酵时间做了不同试验，将大豆分离蛋白添加到牛乳中研制出了混合发酵性双蛋白酸奶；郑立红^[6]等人将大豆分离蛋白溶解液替代部分牛奶制备发酵酸奶，并对质量的影响因素进行了研究；王银安^[7]等人探讨了大豆分离蛋白在酸性乳饮料应用过程中对产品组织状态的影响以及大豆分离蛋白在应用过程中的最佳操作工艺条件。国外针对双蛋白食品的开发也取得较大进展。例如，美国每年开发的以大豆蛋白为基料的奶类新品在50种以上，欧洲市场以大豆蛋白为基料的双蛋白奶、酸奶和甜品日益增多，并以每年20%以上的速度迅速增长。与此同时，欧美市场还纷纷推出豆奶与牛奶或乳清蛋白相结合的“双蛋白”奶以及豆基婴儿配方奶粉，并将大豆蛋白用于冰淇淋、巧克力及婴儿食品、汉堡包等制品。在日本、韩国等国家，具有保健功能的大豆酸奶十分流行，它综合了大豆、牛奶、酸奶的优点。葡萄牙也推出了大豆与牛奶各占50%的奶制品，其蛋白质含量约为3.2%。由此可见，双蛋白产品已逐渐成为各国一个新的研究热点。

在双蛋白食品研发中，还面临着一些问题亟待解决。首先就是豆腥味的去除。大豆脱腥的方法大都是在钝化脂肪氧化酶的基础上发展起来的，如物理法、化学法、生物技术法、遮掩法等^[8]。Blagden^[9]研究发现，经过乳酸杆菌和链球菌的发酵作用能完全除去豆乳中导致产生豆腥味的乙醛。李新华等^[10]人通过筛选优良的乳酸菌及菌株复配，获得组织状态好、无豆腥味的发酵豆浆。由此可见，乳酸菌发酵在豆乳的脱腥问题解决上能够取得良好的效果。其次，如何将大豆蛋白的豆香味和牛奶的奶香味完美地结合在一起，也是一个需要解决的技术难点。常规的解决方法就是通过添加食用香精对双蛋白营养乳的香气进行调配，使植物蛋白和动物蛋白两种风味的结合自然而不突兀。但这样做也存在较多的问题，例如食用香精尚无良好生产规范和合理的标签标准、如何进行卫生的管理等等。因此，天然、无害的办法才是解决问题的关键，乳酸菌发酵为豆乳和牛乳香味转化、融合及提升提供了一个潜在的不错选择。

通过对国内外双蛋白产品的研究和开发现状分析可以看出，大多数双蛋白产品均涉及到乳酸菌的添加使用。已有许多研究报道指出利用乳酸菌发酵豆浆及牛奶，对人类均有相当大的益处^[11,12]。经乳酸菌发酵后的豆浆既保留了其营养成分，同时也减少了胀气因子的存在，明显提高了大豆蛋白质的消化率且大豆异黄酮等功能性成分也会有所增加^[13]；此外还能产生一系列生理活性物质，如短链脂肪酸、B族维生素、胞外多糖等功能成分^[14]。但同时也存在着产品质地和风味不佳的问题。牛奶经乳酸菌发酵则能够减少乳糖不耐症的发生，其风味和营养也得到了进一步提升。

本研究正是在前人的这些研究基础之上，以豆乳和牛乳为混合发酵基质，利用自行分离的植物源高产胞外多糖乳酸菌菌株——保加利亚乳杆菌H-3进行豆乳发酵和产品质地改良，酸奶生产菌嗜热链球菌ST3进行牛乳发酵和产品风味改善，同时添加谷氨酰胺转氨酶协同凝胶，从而开发一款富含活性乳酸菌的新型酸乳酪产品，实现动植物蛋白优势互补与乳酸菌益生特性的完美结合。该项目的实施可以为功能性动植物双蛋白食品的开发提供新的思路和研究方向。

参考文献

[1] Emmert J L, Baker D H. Protein quality assessment of soy products [J]. Nutrition Research, 1995, 15(11): 1647-1656.

[2] 吴祖兴, 杨倩. 新型双蛋白奶产品的研究[J]. 食品科技, 2008, 33(10): 25-28. 

[3] 罗薇, 李晓东, 张福军, 等. 大豆分离蛋白在乳制品中的应用[J]. 中国乳品工业, 2007, 35(6): 62-64.

[4] 魏亚歌. 双蛋白干酪加工关键技术的研究[D]. 吉林: 吉林大学, 2012.

[5] 刘安让, 赵亚萍, 左文成. 新型双蛋白酸奶的研制[J]. 中国食品添加剂, 2008 (5): 143-145.

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[7] 王银安, 洪梓申, 胡德亮, 等. 酸性双蛋白乳饮料中大豆分离蛋白的预处理工艺[J]. 中国乳品工业, 2008, 36(3): 27-29.

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[9] Blagden T D, Gilliland S E. Reduction of levels of volatile components associated with the “beany” flavor in soymilk by lactobacilli and streptococci [J]. Journal of Food Science, 2005, 70(3): 186-189.

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[12] Champagne C P, Tompkins T A, Buckley N D, et al. Effect of fermentation by pure and mixed cultures of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus helveticus on isoflavone and B-vitamin content of a fermented soy beverage [J]. Food Microbiology, 2010, 27(7): 968-972.

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[14] Wang Y C, Yu R C, Yang H Y, et al. Sugar and acid contents in soymilk fermented with lactic acid bacteria alone or simultaneously with bifidobacteria[J]. Food Microbiology, 2003, 20(3): 333-338.

1 创新点

通过植物源高产粘乳酸菌菌株和酸奶生产菌协同发酵，生产具有良好感官品质的功能性双蛋白发酵食品。

2 项目特色

利用植物源高产粘保加利亚乳杆菌进行豆乳发酵和产品质地改良，酸奶生产菌嗜热链球菌进行牛乳发酵和产品风味改善，同时添加TG酶协同凝胶，解决目前发酵豆乳质地和风味不佳的技术难题。产品兼具植物-动物蛋白互补营养特征，以及凝固型酸奶酸爽细嫩的感官特性，富含活性益生菌，符合居民健康需求，具有广阔的市场前景。

1 技术路线

2 研究方法

2.1 菌种活化

将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌甘油管分别接种于豆浆和牛奶中，33℃活化两次备用。

2.2 基本工艺流程

原料---精选大豆---清洗---浸泡---去皮---磨浆---过滤（200目滤布）---根据要求添加不同比例的牛奶---添加蔗糖---煮沸灭菌---冷却接种并添加谷氨酰胺转氨酶（简称TG）---恒温发酵---4℃后熟---成品。

2.3 基本工艺操作要点

①大豆浸泡

选取优质大豆，清水冲洗后室温浸泡9 h，浸泡时大豆和水的比例为1:3（m/v）。

②磨浆

去皮大豆按照一定的水豆比加水进行磨浆。

③加热处理

生豆浆和牛奶混合后煮沸处理5 min左右。

④添加蔗糖

双蛋白混合乳在煮沸灭菌过程中添加5%的蔗糖，一方面可为乳酸菌的生长提供一定碳源，另一方面可起到较好的调味作用。

⑤TG添加

TG可以催化蛋白质分子内和分子间的交联，从而改善产品的弹性、持水性等功能特性。将TG粉末用无菌水稀释到酶活力为10 U/mL。按照所需用量，在混合乳中加入TG稀释液即可。

⑥接种

所用的发酵剂为保加利亚乳杆菌H-3发酵好的豆浆和用嗜热链球菌ST3发酵好的牛奶，所含乳酸菌活菌数均达到10⁸ cfu/g以上，按照所需比例和接种量进行接种。

2.4 酸度测定

准确称取5.00 g后熟后的酸乳酪成品，采用匀浆器将样品捣碎匀浆后加入40 mL新煮沸放至常温的蒸馏水，混合均匀后置于100 mL锥形瓶中，之后再加入2滴酚酞指示液，用标定过的浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠溶液滴定至微红色，30 s 内不褪色即为滴定终点。滴定过程中所消耗的氢氧化钠标准溶液毫升数乘以20即为酸度（^oT）。

2.5 持水力、粘度和硬度测定

样品的粘度采用旋转式粘度计进行测定；持水力的测定采用高速离心法。即准确称量50 ml离心管空管质量（M₀）。样品装入离心管内后称取相应质量（M₁），接着于4℃，8000 g条件下离心15 min后弃上清，称取质量（M₂），持水力的计算公式如下:

持水力(%) = [1 - (M₁ - M₂) / (M₁ - M₀)] × 100

硬度采用质构仪进行分析。参数设置：测定模式：T.P.A 模式；探头型号：p/50；探头直径：D = 50 mm平头探头；探头前速度：1 mm/s；探头测量时速度：5 mm/s；返回速度：5 mm/s；探头移动距离：30%；触发力：5 g；数据采集率：250PPS。

2.6 感官评定

感官评定由黑龙江八一农垦大学食品学院10名以上教师和学生进行，感官评定打分表见表1。各项最高分25分，共计100分。最终评分为所有打分平均值。

表1 感官评定打分表

2.7 单因素试验

   以感官评定得分为指标，通过单因素试验确定水豆比、豆浆与牛奶添加比例、发酵温度、接种量和菌种比例等因素对酸乳酪发酵的影响。

2.7.1 水豆比对双蛋白酸乳酪发酵的影响

选取牛乳豆乳比例1:1，发酵温度33℃，接种量2%，菌种比例H-3:ST3 = 1:1（v/v），TG用量为0.1 U/ml，蔗糖添加量为5%（m/v），考察水豆比（6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1）对酸乳酪凝乳时间、持水力、粘度、硬度、酸度及感官评定的影响。以感官评定得分为指标确定最佳水豆比。

2.7.2 牛乳豆乳添加比例对双蛋白酸乳酪发酵的影响

考察牛奶豆浆添加比例（3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2）对酸乳酪凝乳时间、持水力、粘度、硬度、酸度及感官特性的影响。以感官评定得分为指标确定最佳添加比例。

2.7.3 发酵温度对双蛋白酸乳酪发酵的影响

考察发酵温度（29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃）对酸乳酪凝乳时间、持水力、粘度、硬度、酸度及感官特性的影响。以感官评定得分为指标确定最佳发酵温度。

2.7.4 接种量对双蛋白酸乳酪发酵的影响

考察接种量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）对酸乳酪凝乳时间、持水力、粘度、硬度、酸度及感官特性的影响。以感官评定得分为指标确定最佳接种量。

2.7.5 菌种比例对双蛋白酸乳酪发酵的影响

考察保加利亚乳杆菌：嗜热链球菌菌种比例（1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1）对酸乳酪凝乳时间、持水力、粘度、硬度、酸度及感官特性的影响。以感官评定得分为指标确定最佳菌种比例。

2.8 正交试验

以发酵温度、接种量、菌种比例和豆浆牛奶比例为试验因素，根据单因素试验结果确定因素取值范围，以感官评分为指标进行四因素三水平正交试验，建立酸乳酪最佳发酵工艺条件。

2.9 双蛋白酸乳酪理化分析

2.9.1主要成分分析

水分含量的测定采用直接干燥法；粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法；粗脂肪含量的测定采用索氏抽提法；灰分含量的测定采用基准法；可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法。

2.9.2 乳酸菌活菌数计数

无菌称取25 g酸乳酪样品，加入225 mL无菌生理盐水后匀浆。匀浆液稀释至合适梯度后采用MRS倾注平板法计数。结果以cfu/g表示。具体操作参照国标GB/T 4789.35-2010执行。

2.9.3 持水力、粘度和硬度的测定

具体方法参考2.5。

2.9.4 风味物质的测定

釆用顶空-固相微萃取（HS-SPME）与气质联用（GC-MS）相结合技术对酸乳酪和原料乳挥发性风味物质进行分析和比较。

2.10 功能成分及生物活性

2.10.1 胞外多糖产量

将酸乳酪于4℃、10000 g条件下离心15 min，收集上清液。通过三氯乙酸（TCA）脱除蛋白质、乙醇沉淀、去离子水重溶和透析等步骤获得多糖粗提液并采用苯酚-硫酸法对其多糖含量进行测定。

2.10.2 10 kDa以下肽含量

准确称取200 mg酸乳酪和原料乳冻干粉，加入10 mL pH 9.0 硼酸-氢氧化钠缓冲液，于28℃，120 r/min摇床中提取1 h，再以4°C、10000 g离心15 min，取上清液定容至10 mL即为蛋白提取液。取2 ml上述提取液转移至Millipore超滤管（截留分子量为10 kDa）中，于4℃、6000 rpm/min条件下离心30 min制备渗透液备用。

反应液的配制：将200 mg SDS和7.62 g四硼酸钠用150 mL双蒸水完全溶解，用4 mL乙醇溶解160 mg 邻苯二甲醛（OPA），倒入其中摇匀，再加入176 mg DTT和400 μL β-巯基乙醇，用双蒸水定容至200 mL为OPA反应剂（避光保存，现配现用）。

吸取50 μL渗透液与2 mL OPA试剂反应，在室温下反应2 min。测波长340 nm处的吸光度值。用蒸馏水代替样品滤液与OPA反应，作为空白对照。以胰酪蛋白胨浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，计算肽含量（mg/mL）。

2.10.3 ACE抑制活性

准确称取40 mg原料乳和酸乳酪冻干粉，用0.1 mol/L pH 8.3的硼酸-硼砂缓冲液振荡提取1 h，再以4°C、10000 g条件离心15 min，取上清。将上清液用0.45 μm水系滤膜过滤，冻存于-18°C冰箱中。按照表2添加各试剂，振荡混匀后放入37°C摇床，120 r/min反应30 min，加入85 μL浓度为1 mol/L的盐酸终止反应，过0.45 μm水系滤膜后待测。

表2  ACE抑制反应的体系

HPLC条件为，分析柱：C18色谱柱（12.5 × 4.6 mm，5 μm，柱温25°C）；流动相：50%（V/V）甲醇水溶液（含0.1% TFA）；流速：0.8 mL/min，检测器：光电二极管阵列检测器（DAD）；检测波长：228 nm；进样量：20 μL。按下列公式计算：

ACE 抑制活性（%）= （Ac-As）/(Ac-Ab) × 100

通过测定马尿酸（HA）的吸光度值来计算ACE抑制活性。式中Ac为阳性对照的峰面积；Ab为阴性对照的峰面积；As为样品的峰面积。

2.10.4 抗氧化活性

将酸乳酪于4℃、10000 g条件下离心15 min，依据文献和试剂盒说明书对上清液的DPPH、ABTS⁺自由基清除能力和铁离子还原力（FRAP）进行分析。

2.11 贮藏期试验

   分别测定贮存21 d内单数天时4℃冷藏产品的品质指标，用于保藏期的确定。pH、酸度、感官评分、乳酸菌活菌数、持水力和粘度的测定参考理化分析部分；质构特性采用质构仪按照2.5部分参数设置进行分析。酸乳酪属于半固态食品，表征半固体食品的质构参数有硬度、弹性、脆度、胶粘性、内聚性。由于该产品含水量较大，不宜选用脆度作为其质构的评价指标，所以选用硬度、胶粘性、内聚性和回弹性来反映酸乳酪质构特性；产品的大肠菌群、霉菌和酵母总数依据GB 4789.1-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验总则》进行检验和计数。

3 拟解决的问题

通过优良发酵剂协同发酵及双蛋白复配，解决发酵豆乳质地和风味不佳的技术难题，以及我国居民动植物蛋白摄入结构性失衡问题。

4 预期成果

1、研发一款功能性双菌双蛋白酸乳酪产品；

2、发表研究性学术论文1篇；

3、提交研究技术报告1份；

4、培养本科生5名。

2022.05-2022.09        建立发酵工艺条件；

2022.10-2022.11        测定产品理化性质；

2022.12-2023.03        分析产品功能成分及生物活性，发表学术论文1篇；

      2023.04-2023.05   分析产品贮藏期品质及项目结题。