玉米雄性核不育遗传鉴定及生理生化分析

玉米是世界三大粮食作物之一，具有高产稳产、抗逆性强、适应性广等特点，是杂种优势利用中具有代表性的作物。随着我国经济发展，劳动力大量向城市转移，导致玉米制种基地劳动力紧张，去雄延误等问题出现。然而，玉米雄性不育在玉米杂交制种过程中具有重要的意义，它不仅可节省大量人工去雄、降低种子成本，而且可减少因去雄不净所造成种子混杂，而提高种子纯度。因此，本项目以田间发现的7024雄性核不育突变体为研究对象，通过不育表型观察、遗传学、细胞学、生理生化指标等方面的鉴定，初探7024雄性核不育突变体的败育机理，为后续该不育系的研究与利用奠定基础。

① 7024雄性不育突变体遗传分析

a. 雄性败育表型鉴定

从植株散粉初期至结束每天进行单株育性调查，记录植株散粉情况；在植株散粉期从雄穗中部随机剥取花药，观察花药颜色，用游标卡尺测量10个花药的长度和宽度，比较可育株和不育系株间差异；将花药放置在载玻片上，用解剖针将花药沿横轴切断，挤出花粉粒，1%的I₂-KI 染色，显微镜下观察花粉粒的可染性，分析花粉活力情况。

b. 构建不同遗传背景育性分离群体

2022年组配7024(不育)×Mo17Ht、7024(不育)×B73、7024(不育)×17-703不同遗传背景杂交组合；2022年冬季海南育种基地播种各杂交组合F₁世代，自交获得F₂代分离群体，并以7024不育系为母本回交获得BC₁F₁世代分离群体；2023年安达育种基地观察F₂及BC₁F₁分离群体可育与不育植株数，利用卡方检验计算分离比例，从而确定7024雄性败育突变体的败育类型及基因调控对数。

② 细胞学败育时期鉴定

a. 临时装片观察方法

在抽穗季节，用手摸花序部分，如感到松软，即用刀在喇叭口纵切一刀，取出数条花序分支，如果主穗先端小穗颖长达到3-4mm时取样，单株挂牌，每隔1d取主穗中部小穗。所取小穗置FAA固定液中固定24h后，于FAA中(4℃)长期保存备用。选取固定后2-3mm长的花药压片，用解剖刀横断花药，挤出花药药室内细胞，经过醋酸洋红染色，数码显微镜(BA 2100 igital)下观察游离细胞的形态，并照相。

b. 石蜡切片观察

从大喇叭口期至雄穗发育完成，对供试材料每日取样，选出各个时期的可育株雄花和不育株雄花，从茎中部横切幼嫩的雄穗，剥取新鲜花药，经FAA固定液固定，经固定后的花药分别用30%、50%、70%、85%、95%乙醇逐级脱水，1/5、2/5、3/5、4/5二甲苯和纯二甲苯透明，逐级浸蜡透蜡之后用纯蜡包埋，用切片机切片，横切片厚度为8μm，用明胶粘片，干燥后进行脱蜡、透明，晾干后加一滴树胶进行封藏，用Olympus.BH显微镜观察照相。

③ 生理生化指标测定

以7024群体中可育与不育植株为分析对象，于不同时期取样测定胜利生化指标，具体内容如下：

营养生长期：苗期叶片（三叶一心期幼苗）、拔节期叶片、抽雄期雄穗功能叶片和散粉期雄穗功能叶片。各时期取样至少混合5株叶片，低温保存备用。

雄穗发育期：花药刚开始发育、穗长不超过10cm为时期1，花药发育完全、雄穗刚要抽出为时期2、雄穗完全抽出但没散粉为时期3，散粉期为时期4。剥取4个时期雄穗花药，至少混合10株取样，低温保存备用。

以上每个取样点均设置3次生物学重复。

采用NBT光还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性；高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶（CAT）活性；AsA法测定抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性；硫代巴比妥酸法测定二醛（MDA）含量；蒽酮法测可溶性糖含量；考马斯亮蓝法测可溶性蛋白含量；酸性茚三酮法定脯氨酸含量。

玉米(Zea mays)为雌雄同株，是杂种优势利用典型的代表性作物^[1]。然而杂种优势利用制种过程，母本的花粉会严重影响种子的纯度，那么去雄就显得尤为重要。但去雄不仅耗时、耗力且降低杂交种子的质量和产量。因此，利用雄性不育系是扩大玉米杂交育种规模的理想选择。植物雄性不育是指雄性器官不能正常发育，但雌性器官发育正常，可以与其他有功能的雄配子受精结实，且雄性不育能够稳定遗传的现象^[2]。导致雄性不育现象产生的因素有很多，如基因漂移、基因突变、光照周期及温度的改变等^[3]。雄性不育按照遗传方式的不同，可以分为2类：细胞核雄性不育(genic male sterility, GMS)和核质互作雄性不育（cytoplasmic male sterility, CMS），其中细胞核雄性不育还分为显性核不育、隐性核不育以及光温敏核不育。玉米的CMS应用非常广泛，据Darrah等报道，1979年美国利用各类CMS系配制的杂交种占种子生产量的17.5%，其中T型1.3%、C型14.1%、S型2.1%；1984年种子生产量为11.6%，其中C型8.3%、S型3.3%^[4]。中国农业大学采用掺和法对豫玉22号的不育胞质杂交种进行推广利用，并且形成了一定的推广面积^[5]，其中2003年，制种面积达866.67 hm²，可供16.67万hm²生产使用，累计推广面积约573万hm^2[6,7]。尽管迄今已发现约100 多种玉米CMS 材料，但是受小斑病菌专化侵染和雄花育性不稳定的影响，且“三系”配套增加制种成本，导致能在生产上应用的并不多。然而，细胞核雄性不育系的选育不受恢复基因的限制，且没有细胞质不育基因的不利性状，应用潜力较大。目前，已经发现并命名的玉米核不育基因有200多个^[8]，但仅有少数的几个基因得到克隆，如：ms8^[9]、ms9^[10]、ms22/msca1^[11,12]、ms23^[13]、ms26^[14]、ms32^[15]、Ms44^[16]、ms45^[17]、apv1^[18]、ipe1^[19]、macl^[20]、ocl4 ^[21]。

前人对玉米雄性不育系遗传分析做了大量研究。如，张欢欢^[22]等将晋玉1A×昌7-2、晋玉1A×G155和晋玉1A×昌7-2无叶舌获得F₁代植株再分别自交，并通过调查F₂代群体散粉期单株雄穗的开花、散粉情况的方式来进行遗传群体的育性分析；朱永卉^[23]通过构建不同的( ms39×Mo17)回交群体、(ms39×B73) F₂分离及回交群体对ms39定位结果进行验证；康丹^[24]通过构建ms2×B73 F₂分离群体、ms2×PH4CV F₂分离群体以及ms2×B73 F₃分离群体来对ms2突变体进行遗传分析；柳双双^[25]通过调查ms30 ×昌7-2和 ms30 ×郑58的F₂分离群体育性比例来进行玉米核不育突变体ms30的遗传分析。通过以上研究发现，选用不同的遗传背景来鉴定玉米雄性不育系的遗传基础是非常必要的。

此外，不同雄性不育突变体的败育类型和特征不尽相同，掌握花药败育发生的确切时期、部位和特征是深入研究雄性不育机制的基础，将有助于更好地用于农业生产。研究发现，Wang等^[26]利用苏木精醋酸洋红对玉米雄性不育突变体ms8花粉母细胞减数分裂过程染色观察发现，该突变体花粉母细胞形态呈不规则状，在二分体时期就已败育解体；樊建青等^[27]以小麦光温敏核雄性不育系BS366为材料，采用卡宝品红染色观察花粉母细胞减数分裂过程发现，不育环境下的BS366花粉母细胞减数分裂过程中表现出染色体散乱排列、分离不同步以及细胞质不完全分裂、细胞板不平整、子细胞大小不一等特征，认为这些异常可能是造成花粉败育的主要原因。何金华等^[28]用间接免疫荧光标记(Indirect-immunofluorescence)细胞微管，PI 染色观察发现同源四倍体水稻微管组织的异常可能与染色体的行为异常存在一定的关联，两者共同影响花粉发育，导致其育性偏低。对于成熟花粉育性和活力的检测方法主要包括花粉萌发测定法、TTC法、I₂-KI染色法和Alexander染色法^[29]等，这些方法对多数植物花粉育性都能有效鉴别，但基于操作简单方便，通常会选用后面两种方法。Alexander 试剂染色后，可育花粉呈红色，而败育的花粉染色反应呈现绿色。玉米花粉富含淀粉，不育花粉不积累或积累较少淀粉，用I₂-KI染色不着色或是染色浅，可育花粉染色成棕黑色。

为了探究玉米雄性不育系的生理生化特征，前人也做了大量的工作基础。汪燕等^[30]研究发现，与可育株K305F相比，不育株K305ms雄花发育过程中花药与颖壳的可溶性蛋白含量和游离脯氨酸含量均不同程度降低，而POD活性显著或极显著升高。张勤^[31]等发现不育株叶片中的抗氧化酶活性总是低于同期可育株，并且不育株叶片中的MDA和H₂O₂含量、O^2-产生速率高于同期可育株，说明叶片中抗氧化酶活性低、活性氧积累多可能是引起雄性不育的原因之一。不育株叶片中的叶绿素、脯氨酸和可溶性糖的含量均低于同时期的可育株，特别是在雄穗发育初期可溶性糖含量显著低于可育株，说明光合效率低及营养物质缺乏可能会导致雄穗发育异常。周国昌等^[32]研究发现，造成K932MS败育的原因可能是由于不育花药中营养物质的严重不足，同时不育花药的CAT和SOD活性降低、POD活性升高，不利于花药的正常生长发育。以上研究说明，玉米细胞雄性不育可能与花药发育过程中物质代谢营养缺乏、抗氧化系统异常、光合效率低等有关。那么，弄清玉米雄性不育生理生化特征对于研究玉米雄性不育系的败育机理来说是必不可少的。

因此，本项目拟利用玉米自交系7024雄性核不育系为研究对象，利用不同遗传背景材料组配杂交组合，分析后代可育与不育的分离比例，从而确定该材料的不育性及基因调控对数；利用临时装片及石蜡切片鉴定不育系的败育时期；测定7024不育株和可育株各生育时期叶片及雄穗生理生化指标，为后续该不育系的研究与利用奠定基础。

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1.技术路线

2.拟解决的问题

（1）鉴定7024雄性核不育系败育生物学和细胞学特征；

（2）为7024雄性核不育系的机理研究奠定理论基础。

3.预期成果

（1）研究报告一份

（2）发表核心期刊论文1-2篇。