马铃薯StCDF基因不同光周期调控块茎形成机制研究

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是我国第四大主粮作物，马铃薯因其产量高、适应性强、加工增值显著等特性在世界各地广泛种植。2020年中国马铃薯种植面积559.6万hm²，总产量12294.4万t，种植面积和总产量均占世界第一位。

光作为物理环境因子，对试管薯的诱导、膨大期物质积累以及光合产物的转运具有重要调节作用。近年来，人们逐渐意识到优化光环境因子来提高马铃薯脱毒试管薯产量和质量。光周期和温度是影响马铃薯块茎形成的关键因素。光周期在马铃薯块茎形成的诱导和启动中起着重要作用, 也是研究最为广泛的环境因素。    CDF (Cycling Dof Factors)蛋白是近几年来发现的一类特殊的植物转录因子，在光周期调控开花和抵御非生物胁迫中发挥至关重要的作用。StCDF1是生物钟基因(StGI、StFKF1)与移动块茎信号StSP6A之间的中枢调节因子, 控制植株生长周期和块茎形成。 StCDF1等位基因变异使其可在白天稳定表达，导致StSP6A积累，甚至在长日照条件下也积累，引起长日照条件下块茎形成。

马铃薯块茎形成是一个复杂的调控过程，虽然越来越多的证据使得其调控网络己初具轮廓，但部分通路仅依靠基因表达水平或者拟南芥开花途径推测而来，还有部分仅仅停留在假设的层面，一些重要节点的调控机理仍有待大量实验去完善与证实。

本研究以马铃薯CDF蛋白为切入点，对马铃薯StCDF基因进行生物信息学分析，并构建基因沉默载体和超量表达载体分别转化马铃薯，通过结薯性状变化和表达量分析，从基因沉默和超量表达2个角度，准确解析StCDF基因在试管苗结薯过程中的功能。

（1）CDF家族基因生物信息学分析

在马铃薯基因组数据库(http://spuddb.uga.edu/)及phyotzome植物基因组网站(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/)中以“Cycling Dof Factors”为关键词进行搜索获取马铃薯CDF蛋白的全部成员。在SMART (http://smart. emblheidelberg.de) 数据库对候选基因进行保守结构域的验证，以确定其含有CDF典型的保守结构域。Phytozome数据库中获取拟南芥、番茄及大豆的CDF基因, 并利用DNAMAN软件对玉米拟南芥、番茄、及大豆 CDF基因的氨基酸序列进行多重比对, 比对结果用MEGA5 (http://megasofitware.net) 进行系统进化分析。

（2）StCDF 基因在不同光周期下对块茎形成功能研究

研究和分析StCDF表达规律，构建StCDF基因超量表达载体和RNAi表达载体并转化马铃薯品种费乌瑞它；转化植株不同光周期下验证其结薯能力，通过荧光定量 PCR对StCDF基因进行表达分析，从而明确StCDF对试管块茎形成的作用功能。

（3）马铃薯StCDF在块茎形成中的作用机制解析

系统分析了StCDF、StCO、 StSP5G、StSP6A等基因在长短日照条件下连续48h的表达情况，推测对StSP5G的表达具有直接转录抑制的功能。通过分析StSP5G的启动子序列找到可能的StCDF1/2的转录因子结合位点，并通过酵母单杂交验证了StCDF蛋白与StSP5G启动子的结合。

3.1植物CDF蛋白的功能

       人们对Dof蛋白的认识起源在全世界广为种植的谷类作物玉米(Zea ways)中发现的第一个Dof蛋白MNB1。 Dof家族由于其蛋白质氨基酸序列的保守性和功能的多样性受到了越来越多人的重视，大量的Dof基因被分析鉴定出来。高等植物如拟南芥、水稻、大麦、面包小麦、高粱和花生。甚至一些低等植物如绿藻植物莱因衣藻；苔鲜植物小立碗鲜中均有Dof可基因的报道。

        首次Dof家族进化树分析通过将拟南芥全体Dof蛋白及来自玉米、大麦、小麦、烟草和水稻等的部分Dof蛋白氨基酸序列进行序列比对和同源性分析分析表明，Dof家族分为7个不同的亚家族，Lijavetzky等(2003)将36个拟南芥Dof蛋白以及30个水稻的Dof蛋白做进化树分析，并根据内含子一外显子结构，保守氨基酸序列和功能域的情况，将其进一步分为Aa, Bb,  Cc和Dd共4个亚家族。

       CDF （ Cycling  Dof  Factor）蛋白属于D亚族Dof蛋白，目前在拟南芥、番茄、水稻、马铃薯，茶树等高等植物中己有报道。大量研究发现CDF蛋白在光周期调控开花、调节碳氮平衡、提升净光合速率以及抵御非生物胁迫方面发挥重要作用。

3.2 CDF蛋白对开花的影响

       在拟南芥中，光周期调控其开花时间在很大程度上取决于FT基因编码成花诱导素的水平。长日照条件下诱导FT基因高水平表达，促进提前开花，短日照条件下则相反。FT基因的表达水平受到上游一系列转录因子直接或间接的调控。FKF 1和GI是CDF蛋白的抑制因子，他们在蓝光存在的条件下形成稳定的复合物通过与AtCDF 1和AtCDF2蛋白结合后诱导其降解，从而解除了对CO基因的转录抑制，促进其大量表达。

    CDF基因日表达量变化模式是光周期控制开花时间的核心，拟南芥中存在多个生物钟因子来调控AtCDF基因的表达。上午光照开始时，CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 （CCA1）和LATEELONGATED HYPOCOTYL （LHY）蛋白感受自然光信号诱导AtCDFl的表达，导致CO的转录水平降低，抑制开花。拟南芥cdf1235突变体表现出对光周期不敏感，因此AtCDFl的转录水平是拟南芥区分光周期的关键。下午光照逐渐减弱后，AtCDF基因的转录水平又受到转录阻遏蛋白PSEUDO RESPONSE REGULATOR  (PRR)家族的调控，其中PRRS，PRR7和PRR9蛋白分别于至少三AtCDF （AtCDF2，AtCDF3和AtCDF5）基因的启动子结合，并抑制他们的表达。同时CCA1和LHY等开花相关基因的表达也受到PRR蛋白抑制。

      其他开花植物中也发现了类似的CDF转录因子调控开花的分子机制。如番茄中SICDF，基因的表达量受光周期影响，拟南芥中过表达番茄SlCDF3导致长日条件下延迟开花，且CO和FT蛋白的mRNA水平降低，与拟南芥AtCDFl功能相似。在短日照植物水稻中也发现AtCDF的同源基因OsDofl2，它的表达量受生物钟节律和光周期调控。水稻中过表达OsDofl2基因导致其在长日照条件下提前开花，同时Hd3a （heading date3a）属于FT-like亚家族的转录水平明显升高。 OsDof4与OsDofl2同处于一个亚家族，在水稻中过表达OsDof4导致其长日照条件下开花提前，短日照条件下开花延迟，并且长日照条件下Hd3a， RFTl和Ehdl等与开花相关基因的表达量明显升高，与短日照条件下表达模式相反。另外，在其他物种的同源基因中也发现类似规律。 CDF蛋白作为转录因子可以通过与启动子顺式元件结合直接或间接的调节FT基因表达。在大多数开花植物中，不同的CDF蛋白调节不同的FT-like基因，但在大多数植物中CDF蛋白调控开花的分子机制是未知的。

本研究以CDF在不同光周期下马铃薯块茎的形成为背景，对StCDF介导调控马铃薯块茎形成的机制进行研究。

（1）首次研究马铃薯StCDF对块茎形成的作用

关于拟南芥、番茄等作物中CDF的功能已有报道，马铃薯CDF的相关报道非常有限，本研究将注意力集中于StCDF，研究其对马铃薯块茎形成中的作用。

（2）首次揭示StCDF调控马铃薯块茎形成的分子机制

现有研究表明拟南芥CDF对拟南芥开花具有调控作用，但目前尚未有研究报道CDF如何调控马铃薯块茎形成过程。本项目拟通过StCDF对下游结薯因子互作研究，揭示StCDF基因调控马铃薯块茎形成分子机制，具有明显的理论创新。

 1）技术路线：

 2）拟解决的问题

科学问题1： StCDF基因在不同光周期下对马铃薯块茎形成的作用

马铃薯在短日照下能够促进结薯， CDF基因参与光周期调控过程，那么CDF素对马铃薯结薯是否具有积极作用，本研究构建StCDF基因RNAi表达载体及超量表达载体并转化马铃薯验证其在块茎形成中所起的作用。

科学问题2：StCDF在马铃薯块茎形成中的作用机制及调控途径

StCDF是如何调控块茎形成的，其作用机制是什么，本研究通过马铃薯StCDF基因表达模式探究，筛选与块茎形成相关信号途径，从而揭示马铃薯StCDF基因表达模式。

3）预期成果

（1）鉴定马铃薯StCDF基因对块茎形成的生物学功能；

（2）揭示马铃薯StCDF基因调控块茎形成的分子机制；

（3）核心期刊发表论文1篇

（4）形成研究报告1份

2022.5-2023.7

（1）CDF基因生物信息学分析及功能预测

（2）StCDF基因沉默和超量表达株系转化马铃薯

2022.8-2022.9

（1）StCDF因沉默和超量转化株系诱导结薯

（2）StCDF因沉默和超量转化株系结薯性状鉴定

2022.10-2023.3

（1）StCDF与下游结薯因子互作研究

（2）明确StCDF对结薯作用的调控机制

2023.4-2023.5

（1）整理数据

（2）撰写结题报告