玉米ZmbZIP76转录因子在盐碱胁迫下的功能鉴定和调控机制解析

随着全球水资源匮乏和土壤水质的盐碱化，干旱、低温和盐碱等非生物逆境已经成为植物生长发育的主要限制性因素。玉米是我国三大粮食作物之一，其生产同样频繁受到环境逆境的威胁，逆境制约了玉米出苗时间与发芽率, 并影响其产量。因此，对其进行非生物逆境信号调控网络的研究，找到能提高玉米抗性的关键基因对于提高玉米产量至关重要。

植物为了生存，在遭遇非生物逆境时，必须通过形态、生理生化代谢和细胞分子水平等方面的调整，以适应或忍耐环境胁迫。转录因子通过与靶基因启动子区域中顺式元件特异性结合调控一系列逆境相关基因的表达。因此，在作物抗逆育种过程中与传统的转入一个或多个功能基因相比，通过转入转录因子能够使作物的抗逆性得到更为根本、更为综合的改良。

碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）蛋白是真核生物所特有的一类转录因子，目前有关玉米bZIP 家族基因参与逆境反应的报道很有限，大多数成员的功能尚且未知，因此研究bZIP家族基因在逆境下的功能有助于丰富转录因子调控的玉米逆境应答分子调控网络，同时筛选到关键抗逆基因，为进一步利用转基因手段培育玉米抗/耐品种提供理论基础和基因准备。

（1）玉米ZmbZIP76转录因子特性分析

① ZmbZIP76基因在ABA、盐碱、盐、旱处理下的表达模式：分别用ABA、NaHCO₃、NaCl和PEG处理二叶时期的玉米幼苗，根和地上部分分开取材，提RNA，反转录为cDNA，利用实时定量PCR分析ZmbZIP76基因的表达模式（已完成）。

② ZmbZIP76的二聚作用分析：已知ZmbZIP76单体不具有转录自激活活性，拟利用酵母双杂交进一步鉴定ZmbZIP76的同源或异源二聚作用。

③ ZmbZIP76的亚细胞定位分析：将ZmbZIP76基因ORF序列去掉终止密码子与GFP相融合，构建重组载体，农杆菌介导法侵入洋葱表皮，激光共聚焦显微镜下观察。

（2）ZmbZIP76基因在盐碱胁迫反应中的功能分析

将ZmbZIP76转入拟南芥，获得过表达ZmbZIP76的T3代转基因纯合株系（已获得）。用不同浓度NaHCO₃处理野生型拟南芥和转基因拟南芥。以野生型为对照，分析胁迫后转基因拟南芥的盐碱胁迫表型、ABA敏感性和光合速率变化；测定根长、根毛、根际pH变化；统计ROS水平、抗氧化物酶活性、细胞死亡和细胞膜损伤情况。

选取启动子中含有ABRE元件的盐碱应答marker基因，测定它们在ZmbZIP76过表达株系中的相对表达量。

碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）转录因子对植物应答逆境具有重要调控作用（Pan et al.,2022; Zhou et al., 2022; Qu et al., 2022）。TabZIP15正向调控小麦对盐胁迫的耐受性，苹果MdbZIP80负向调控干旱和盐胁迫耐受性（Bi et al., 2021; Feng et al., 2021）。水稻bZIP73^Jap在苗期和生殖期植物耐冷调控过程中发挥重要作用（Liu et al., 2018; Liu et al., 2019）。目前在玉米中对bZIP抗逆功能的报道有，但很有限。玉米ZmbZIP72和ZmABP9基因分别在拟南芥和棉花中提高了植物对盐和干旱的耐受性 （Ying et al. 2012; Wang et al. 2017）。玉米bZIP60耦联UPR途径参与调控热胁迫反应（Li et al., 2020）。最近的研究发现玉米bZIP68是冷胁迫耐受性中的负向调节因子（Li et al., 2022）。鉴于bZIP在非生物胁迫下的重要功能和目前对玉米bZIP的报道较少，有必要挖掘更多玉米bZIP抗逆基因，为作物抗逆分子育种提供基因准备。

Jakoby等（Jakoby et al., 2002）根据碱性结构域及保守结构域，将拟南芥的75个bZIP类转录因子基因家族成员分为A、B、C、D、E、F、G、H、I 和S 类10个亚家族。A亚族bZIPs主要在种子和植物组织对ABA和逆境胁迫的响应信号网络中发挥重要作用。例如，在拟南芥萌发和幼苗早期阶段，ABI5蛋白的活性受ABA的调控，过表达ABI5基因能提高转基因拟南芥对ABA的敏感性，在干旱条件下参与靶基因的转录调控，对植物抗逆性起重要作用（Lopez-Molina et al., 2001）。Ying等从玉米中克隆获得一个A亚族成员ZmbZIP72，转到拟南芥中表达，转基因拟南芥显示出提高的抗旱性和耐盐性，过表达ZmbZIP72增强了转基因拟南芥种子对ABA和渗透胁迫的敏感性（Ying et al., 2012）。除了A亚族，其它的亚族也存在与胁迫应答相关的转录因子，大豆bZIP 转录因子 GmbZIP44，GmbZIP62和GmbZIP78分别属于第S、C 和G 亚家族，在拟南芥中过表达，均能提高转基因拟南芥对盐和低温胁迫的耐受性（Liao et al., 2008）。B亚族的两个基因AtbZIP17 (At2g40950)和AtbZIP28 (At3g10800)调控盐胁迫反应和内质网胁迫反应（Liu et al., 2007a, 2007b）。有报道显示拟南芥F亚族的AtbZIP24 转录因子，在逆境应答胁迫网络中发挥复杂的转录调控作用（Yang et al., 2009）。但是玉米中bZIP类转录因子F亚族成员参与抗逆反应尚未见报道，因此，有必要关注玉米bZIP的F亚家族成员在逆境下的表现。

在极端环境条件下，有效的抗氧化系统是植物抵抗逆境的一个有用途径。Kranner等（Kranner et al., 2002）发现在逆境胁迫条件下过量表达转基因烟草ThbZIP1基因，可以提高过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，增加可溶性糖和可溶性蛋白的含量，还可以促进活性氧的消除（Wang et al., 2010）。玉米中发现的 bZIP 转录因子ABP9 通过调节ABA信号和细胞内的ROS水平提高转基因拟南芥对多种逆境的耐受性（Zhang et al., 2011）。过表达玉米ABP9的棉花显示出提高的盐和旱耐受性，增加的抗氧化物酶活性和减少的ROS水平（Wang et al., 2017）。此外，植物在逆境条件下过量表达bZIP类蛋白类可提高植物的光合能力，从而提高植物对盐、冷、干旱、热等各种胁迫的抗性。如在转基因拟南芥中组成性表达玉米ABP9可提高逆境植物的光合作用速率，主要是通过调节光合色素组成、消耗多余光能、增加碳的利用率以及增加ABA含量、诱导逆境防卫基因的表达等来加强光合能力（Zhang et al., 2008）。可见bZIP转录因子在植物逆境抗氧化防御系统和光合作用的调节中具有重要的作用。

玉米bZIP转录因子是一个极为庞大的基因家族，Wei等的全基因组分析发现玉米基因组共有125个bZIP基因编码170个蛋白，参照拟南芥中的分类法将其分为11个亚族，并将全部基因进行编号命名（Wei et al., 2012）。目前，在数量众多的bZIP 转录因子中，功能明确的只占很少一部分，而且多集中于对模式生物拟南芥和水稻的研究，对玉米中bZIP转录因子的报道有但很少，bZIP蛋白参与调控玉米盐碱胁迫应答反应尚未见报道。

申请者所在实验室利用新一代高通量测序Solexa技术建立了玉米根组织在NaHCO₃胁迫0、12、24、72h的4个转录组，通过对其中部分bZIPs表达进行聚类分析，发现了一条在胁迫处理各个时间点均高度响应NaHCO₃的bZIP基因GRMZM2G055413（图1），该基因属于bZIPs 蛋白F亚族，Wei等将其命名为ZmbZIP76。

对该基因在玉米不同组织及逆境胁迫下的表达模式进行了初步探索，发现ZmbZIP76在NaHCO₃胁迫处理后的各个时间点在根部均呈上调表达，这与转录组数据一致。NaCl胁迫处理12 h和24 h时，ZmbZIP76基因在根部呈显著上调表达。PEG 处理24 h时和ABA处理72 h时，ZmbZIP76基因在根中表现出显著上调表达（图2）。以上结果表明在根中ZmbZIP76能够不同程度地被盐、盐碱、旱和ABA诱导表达，说明ZmbZIP76是玉米根部适应非生物逆境过程中一个重要的调节因子。前期已证实ZmbZIP76定位在细胞核，单体不具有转录自激活活性（图5-6），因此有必要研究其同源或异源二聚作用。为鉴定ZmbZIP76基因在逆境反应中的功能，对该基因的CDS序列（全长804bp）进行克隆，将其转入拟南芥，已获得T3代转基因拟南芥种子，并已经初步证明盐碱胁迫下ZmbZIP76过表达株系的根长显著长于野生型（图4）。上述积累为本项目能够顺利实施提供了重要保障。

主要参考文献

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?玉米bZIP转录因子是一个极为庞大的基因家族， Wei等的全基因组分析发现玉米基因组共有125个bZIP基因编码170个蛋白，这些成员分布在11个亚家族。其中仅有少数bZIP成员在植物非生物胁迫反应中的生理和分子调控机制被研究，对于F亚家族成员在逆境中的功能尚未见报道。本课题选取响应盐碱胁迫的F亚家族成员ZmbZIP76（GRMZM2G055413），研究其在盐碱胁迫反应中的功能，以期挖掘更多的bZIP类转录因子，为作物分子抗逆育种提供基因准备。

(1)      技术路线

(2)         拟解决的问题

① 明确ZmbZIP76在盐碱胁迫下的功能；

② 初步揭示ZmbZIP76调控玉米盐碱胁迫应答的生理和分子机制。

(3)         预期成果

① 初步构建ZmbZIP76调控植物盐碱胁迫的分子和生理调控网络；

② 发表论文1-2篇；

③ 完成本科毕业论文1篇。

2022年5月-2022年10月

（1）    ZmbZIP76的亚细胞定位分析；

（2）    ZmbZIP76的二聚化作用研究；

（3）盐碱胁迫表型和ABA敏感性分析。

2022年11月-2023年4月

（1）光合速率测定；

（2）根长统计、根毛发育比较、根际pH变化分析；

（3）抗氧化物酶活性和ROS水平测定。

2023年5月-2023年10月

（1）细胞死亡和膜损伤测定；

（2）盐碱胁迫条件下，分析ZmbZIP76转基因植物体内盐碱marker基因表达的变化。

2023年11月-2024年5月

整理数据，撰写结题报告和论文。