大肠杆菌MFS家族MdtH外排泵的外排机制研究

申报人：梁益民 申报日期：2022-06-18

基本情况

2022
大肠杆菌MFS家族MdtH外排泵的外排机制研究 盲选
创新训练项目
理学
生物科学类
学生来源于教师科研项目选题
一年期
细菌产生耐药性的主要原因是因为一种被称为药物转运蛋白的外排泵，其能够将有毒化合物从细胞内转运到胞外，从而使细菌即使在很高的抗生素浓度下仍能持续生长。本实验通过Red同源重组方法构建基因缺失株，利用pET-28a构建过表达株，以野生型菌株作为对照，进行药物敏感性实验，观察在一系列不同浓度和种类抗生素中的生长情况。验证大肠杆菌MFS家族MdtH外排泵主要外排药物，为后续筛选抗该药外排泵抑制剂奠定基础。
第四作者发表SCI论文一篇
Cloning and Functional Characterization of Putative Escherichia coli ABC Multidrug Efflux Transporter YddA [J]. Microbiol Biotechnol. 2020; 30(7): 982-995.

近三年主持课题及发表论文情况：
主持黑龙江省强省计划项目(TSTAU-R2018012)；黑龙江省重点研发计划项目(GZ20210101)；获得黑龙江省科学技 术进步二等奖。
发表论文：
Effects of Fisetin on Allergic Contact Dermatitis via Regulating the Balance of Th17/Treg in Mice. Comput Math Methods Med. 2022 Apr 9; 2022:9222541. doi: 10.1155/ 2022/9222541.
Immunosuppressive activity of daphnetin on the humoral immune respons- es in ovalbumin-sensitized BALB/c mice. Immunopharmacol Immunotoxicol. 2021 Apr; 43 (2): 171-175. doi: 10.1080/08923973.2021.
Trap抗原诱导细胞免疫对S.aureus免疫保护作用的研究[J]. 黑龙江八一农垦大学学报, 2022, 34(01):79-86.
scFv-DEC205-Trap重组包涵体靶向抗原变复性及过程的优化[J]. 细胞与分子免疫学杂志，已录用.
微生物功能基因组学及病原细菌的致病机制研究[M]. 吉林大学出版社, 2018, 12.

从课题选题、项目实施到项目结题，指导教师都将全程指导。如果经费不足，指导教师将给予资助。
省级

项目成员

序号 学生 所属学院 专业 年级 项目中的分工 成员类型
梁益民 生命科学技术学院 生物工程 2018 主持
王雪跚 生命科学技术学院 生物科学类0710 2021 基因缺失菌株的制备
刘有文 生命科学技术学院 生物工程 2020 PCR引物设计
石圳坤 生命科学技术学院 生物科学类0710 2021 基因高表达菌株的制备
于卓 生命科学技术学院 生物科学类0710 2020 药物敏感性实验

指导教师

序号 教师姓名 所属学院 是否企业导师 教师类型
佟春玉 生命科学技术学院 否

立项依据

细菌耐药性严重威胁公共健康，在传染病和癌症的治疗中带来了极大的麻烦。MdtH 外排泵属于 MFS 家族，为大肠杆菌 K-12 MG1655 菌株内膜上的跨膜转运蛋白，是一种多药耐药转运蛋白，了解药物转运蛋白功能机制对于开发抗菌药物非常重要。考虑到抑制 MdtH 外排泵对药物的外排可以增强细菌对抗生素的敏感性，本研究旨在探究大肠杆菌药物外排泵MdtH外排抗生素的机制，对于开发相关抑制剂药物，治疗耐药大肠杆菌引发的疾病具有一定的临床价值。
1. MdtH基因缺失菌株构建
      Red 重组系统近些年得到不错的应用，基因重组双交换过程在该系统能够在一个实验操作中完成，节省了操作流程，并且无需构建质粒。用 pKD3 质粒上的氯霉素片段作为打靶片段，在 MdtH 基因两端设计同源臂，最后利用 pKD46 表达的重组酶机制同源替换 MdtH 片段，经菌液 PCR 和测序验证，成功构建缺失菌株。

2.  MdtH基因过表达菌株构建
      同时对 pET-28a 质粒和 MdtH基因进行双酶切，进行重组连接，并将重组质粒引入 BL21 菌株中，用 IPTG 诱导重组蛋白表达，进行 Western Blot 验证外源蛋白成功表达。

3. 验证菌株药物敏感性
      研究细菌耐药性的最常用的方法为药物敏感性实验，其中微量肉汤法和药敏纸片法被广泛使用。肉汤稀释法的原理是，在培养基中加入不同浓度抗生素，设置成浓度梯度，培养细菌，并观察不同抗生素浓度培养基中细菌的生长情况。通过测量抑菌圈的直径并与 CLSI 标准进行比较，可以判断菌株的药物敏感性。

外排泵主要外排细胞内的对自身有害的药物，不同外排泵外排的药物种类不同，为了治疗由细菌耐药引起的疾病，外排泵有望成为新的治疗对象，因此，了解外排系统的作用机制，结构特点以及抑制剂对外排泵的作用对于临床抗菌应用十分重要。有文献显示MdtH外排泵在大肠杆菌诺氟沙星耐药中发挥作用，但具体机制尚不清楚。
RNA测序（RNA-seq）可以用于研究暴露于诺氟沙星后外排泵基因表达水平的变化。RNA-seq是一种获得和分析所有 RNA 分子的方法，该方法在新型转录物发现和基因结构表征方面具有优势，可以通过测量差异表达的基因，间接估计它们在药物应激状态中，如何通过相应的增加或减少水平对药物应激状态发挥作用。
有研究显示 MdtH 外排泵可以外排氟喹诺酮类药物诺氟沙星，我们首先对其进行了功能验证，通过构建该外排蛋白的缺失株和过表达菌株，进行对一系列不同种类抗生素的药物敏感性实验，验证该外排泵的外排药物种类。
抑制细菌耐药性的途径之一是开发外排泵抑制剂，抗生素与外排泵抑制剂联用能显著降低菌株的 MIC 值。针对细菌耐药外排泵抑制剂的研究主要为从小分子化合物文库或抗体库中筛选能与外排泵组分相作用的物质。
小分子化合物由于分子量极小，能轻易穿过细胞膜的通道蛋白到达细胞内部，近几十年来一直作为新药来源，为很多疾病的治疗提供了基础。随着高通量高内涵筛选方法地不断优化，大规模筛选小分子化合物库成为最行之有效的方法。

1. 本项目利用Red同源重组方法构建基因缺失菌株，Red重组系统近些年得到不错的应用，基因重组双交换过程在该系统能够在一个实验操作中完成，节省了操作流程，并且无需构建质粒。

2. 验证 MdtH 外排泵主要外排药物种类。

1. 技术路线



2. 项目预期成果及说明

（1) 验证药物外排泵MdtH主要外排药物种类，预期发表论文一篇；

（2) 培养1~2名本科毕业生。


2021.09-2021.10：查阅文献资料筛选耐药基因；
2021.11-2021.12：MdtH基因缺失菌株构建；
2022.04-2022.05：MdtH基因过表达菌株构建；
2022.06-2022.07：验证菌株药物敏感性；
2022.07-2022.08：整理资料准备结题。

1. 基因缺失株PCR鉴定



2. 基因过表达菌株双酶切鉴定



3. MdtH重组蛋白表达


研究主要平台项目为学校生物技术中心细胞生物学实验室，具备从事动物模型构建、细胞培养、生化检测等分子生物学和细胞生物学方面研究的条件和设备，满足开展本项目研究的基础条件和设施。


经费预算

开支科目 预算经费（元） 主要用途 阶段下达经费计划（元）
前半阶段 后半阶段
预算经费总额 10000.00 项目实验材料，论文出版 8000.00 2000.00
1. 业务费 2700.00 无 700.00 2000.00
（1）计算、分析、测试费 0.00 无 0.00 0.00
（2）能源动力费 0.00 无 0.00 0.00
（3）会议、差旅费 500.00 无 500.00 0.00
（4）文献检索费 200.00 文献检索 200.00 0.00
（5）论文出版费 2000.00 论文出版 0.00 2000.00
2. 仪器设备购置费 0.00 无 0.00 0.00
3. 实验装置试制费 0.00 无 0.00 0.00
4. 材料费 7300.00 购买实验材料 7300.00 0.00

项目附件

  • A类-创新训练项目申报书.pdf
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结束

        

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