序号 | 学生 | 所属学院 | 专业 | 年级 | 项目中的分工 | 成员类型 |
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董伟峰 | 农学院 | 农学 | 2019 | OsPHD17调控冷胁迫应答的生理功能研究以及OsPHD17基因的育种潜力评价。 |
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汪青松 | 农学院 | 植物生产类0901-I | 2019 | OsPHD17调控幼苗期耐冷性的功能分析 |
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李东芮 | 农学院 | 农学 | 2021 | OsPHD17调控萌发期耐冷性的功能分析 |
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何鹏旭 | 农学院 | 植物生产类0901-I | 2019 | OsPHD17调控孕穗期耐冷性的功能分析 |
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王姝琨 | 农学院 | 植物生产类0901-I | 2020 | OsPHD17调控萌发期耐冷性的功能分析 |
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序号 | 教师姓名 | 所属学院 | 是否企业导师 | 教师类型 |
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孙晓丽 | 农学院 | 否 |
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水稻是最主要的粮食作物之一,养育了中国2/3的人口,水稻的安全生产直接关系到我国的粮食安全。黑龙江省是我国最大优质粳稻主产区,被誉为国家粮食安全的“压舱石”。但由于地理位置因素,每3-5年就发生1次较严重的低温冷害,导致水稻难以稳产。因此,提高水稻耐冷性对稳定寒地水稻产量,保障我国粮食安全具有重大战略意义。
PHD(Plant Homeo Domain)蛋白具有一个或几个由60个氨基酸组成的Cys4-His-Cys3双环锌指基序,水稻中有59个PHD基因。研究发现,PHD基因调控减数分裂、雄蕊发育、初生根生长、开花等生长发育过程。但对于PHD参与植物胁迫应答研究较少,尤其是PHD参与水稻耐冷研究未见报道。
项目组所在课题组已获得了OsPHD17基因过表达(OsPHD17-OX)和基因敲除(OsPHD17-CRISPR)T3代纯合转基因水稻株系。本项目拟利用转基因水稻材料,分析OsPHD17调控水稻耐冷性的功能,解析OsPHD17 调控水稻冷胁迫应答的生理途径,并评价OsPHD17 基因在耐冷水稻培育中的育种潜力。具体研究内容如下:
1. OsPHD17 调控水稻耐冷性的功能分析
对野生型、OsPHD17-OX及OsPHD17-CRISPR转基因水稻进行萌发期、幼苗期、孕穗期冷胁迫处理,通过表型及形态指标、花粉育性及产量指标进行耐冷性评价,从超量表达和基因敲除2个角度确定OsPHD17的耐冷功能。
2. OsPHD17 调控水稻冷胁迫应答的生理途径研究
对三叶一心期的野生型、OsPHD17-OX及OsPHD17-CRISPR转基因水稻进行冷处理,分析冷胁迫下渗透调节、氧化还原调节、光合作用调控等相关生理指标变化,确定OsPHD17调控冷胁迫的生理途径。
3. OsPHD17 基因在耐冷水稻培育中的育种潜力评价
1. 水稻响应低温冷害的生理机制
低温严重影响全球农业生产,是造成水稻减产的主要非生物因素。科研人员对水稻响应低温冷害的生理机制进行了大量研究,已初步明确了水稻在低温胁迫下生理生化变化。
植物通过光合作用积累有机物、促进形态建成和正常的生长发育。低温胁迫首先抑制水稻体内酶的活性,使得光合作用效率下降、叶绿素合成受阻,严重时导致水稻失绿、枯萎甚至死亡。朱红等研究发现低温会导致水稻叶片净光和速率、气孔导度和蒸腾作用降低、胞间CO2浓度下降,并影响糖等有机物的累积。纪洪亭等发现低温胁迫会损坏植物叶绿体的结构,使叶绿体基粒片层紧密堆叠、以至于出现空缺,最终导致水稻叶绿素的含量显著降低、光合作用受阻。水稻孕穗期遭遇低温胁迫时,叶片的净光和速率、气孔导度和蒸腾速率随着时间的增加而呈现出逐渐下降的变化趋势。水稻胁迫相关蛋白(Stress
associated protein, SAP)家族OsiSAP8基因可通过提高低温胁迫下水稻叶片的叶绿素含量,增强植株耐冷性[1]。OsAsr1超量表达可以显著提高水稻的叶绿素荧光参数Fv/Fm值,增强水稻的抗寒能力[2]。
低温胁迫下水稻可溶性糖的含量显著上升。Yokota等[3]利用耐寒性不同的六倍体小麦证实了果聚糖积累与耐冷性之间的高度相关性,可溶性糖积累可提高植物耐冷性。植物在未受到胁迫时,可溶性糖与淀粉含量处于平衡状态,受到低温胁迫后可溶性总糖含量显著升高,淀粉含量下降,可溶性糖与淀粉含量的比值随之显著升高。Klotke等研究表明,耐冷性不同的拟南芥材料总糖含量几乎相同,但可溶性糖和淀粉含量差异显著,其中耐冷的拟南芥材料可溶性糖含量明显高于冷敏感材料。Price等[4]发现葡萄糖可诱导大量冷应激基因表达以响应低温胁迫。低温下,己糖激酶AtHXK1作为变构调节和信号转导的主要成分,可作为葡萄糖感受器的传递物质和信号调控基因表达和植物生长,在己糖激酶依赖的逆境响应途径中,己糖入膜后被己糖激酶磷酸化引起AMP/ATP变化,再通过蛋白激酶、磷酸酶、钙调素结合蛋白和SNF1复合物向细胞核传递信号,引起相关基因的转录水平的改变[5]。Shao等[6]发现冷胁迫下,海藻糖合成基因OsTPS1(Trehalose-6-phosphate
1)、OsTPP1(Trehalose-6-phosphate
Phosphatase 1)和OsTPP2在水稻中超量表达会显著增加水稻体内的海藻糖的含量,从而增强水稻的耐冷性[7]。
正常生长条件下,水稻体内活性氧(Reactive
Oxygen Species,ROS)含量维持在较低水平;冷胁迫会引起ROS过量积累造成氧化伤害,致使生物大分子如蛋白质和DNA受到损伤。ROS损坏细胞膜中的不饱和脂肪酸和脂肪酸的酯键,从而产生具有很强毒性的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、超氧阴离子O2-、过氧化氢H2O2等物质,引起核酸和蛋白质等大分子发生交联反应,破坏细胞膜稳定性,同时,还会使线粒体中的关键酶失活,从而损伤植物细胞。水稻细胞具有维持ROS平衡的能力,在面对低温等逆境胁迫时细胞中过量的ROS会激活ROS清除系统。ROS清除系统主要包括抗氧化物酶系统和非酶系统。植物体内抗氧化物酶系统主要包括超氧化物歧化酶(Superoxide,SOD)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate
peroxidase,APX)等[1]。
2. PHD基因调控植物生长发育及逆境应答的研究进展
PHD蛋白可作为表观基因组读取器,通过PHD结构域中含芳香环的氨基酸结合甲基化组蛋白调控基因表达。在拟南芥中,PHD结构域-H3K4me3-ALFIN1结合蛋白(ALs)通过转换H3K4me3-to-H3K27me3染色质状态调控种子萌发。水稻开花激活因子OsVIL2的PHD结构域与组蛋白H3结合,提高开花抑制基因OsLFL1染色质的H3K27me水平,降低OsLFL1基因表达[8]。拟南芥ATX1蛋白包含两个PHD结构域,通过与SND1和NST1基因座结合,增强H3K4me2水平,促进拟南芥早花[9]。拟南芥SIZ1蛋白PHD结构域也在组蛋白识别中发挥重要功能[10]。
PHD蛋白也可作为转录因子调控下游基因表达,在植物生长发育中发挥重要作用。木薯MePHD1能与ADP-葡萄糖焦磷酸化酶小亚基1a(MeAGPS1a)启动子-400bp至-201bp区域结合,抑制MeAGPS1a基因启动子活性,表明MePHD1是MeAGPS1a的负调节因子。油菜PHD基因家族中,有18个家族成员响应干旱和盐胁迫[11]。大豆中有6个编码Alfin1-型PHD蛋白GmPHDs通过与GTGGAG顺式元件结合,响应干旱胁迫,其中GmPHD4/5基因受冷胁迫诱导表达上调[12]。GmPHD6超量表达可提高大豆的耐逆性,苜蓿MtPHD6异源表达增强拟南芥耐旱性[13],OsSIZ1基因可正向调控拟南芥的耐旱性、耐热性和耐盐性[14]。
众多研究表明,PHD蛋白不仅通过甲基化调控植物生长发育,它还在植物响应非生物胁迫中发挥重要作用。实验室前期从水稻(Oryza sativa japonica)中鉴定出59个PHD基因,其中有49个参与植物生长发育调控;另外10个与玉米、大豆和苜蓿的PHD家族成员响应逆境胁迫[15]。值得注意的是,只有OsPHD17表达响应冷胁迫。
本项目在前期获得OsPHD17基因过表达(OsPHD17-OX)和基因敲除(OsPHD17-CRISPR)T3代纯合转基因水稻株系的基础上,进一步分析OsPHD17调控水稻耐冷性的功能,解析OsPHD17 调控水稻冷胁迫应答的生理途径,并评价OsPHD17 基因在耐冷水稻培育中的育种潜力。
参考文献
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1. 本项目具有明显的区域特色。黑龙江省是我国纬度最高的水稻产区,年平均气温较低,低温冷害频发,严重影响水稻稳产。本项目立足影响黑龙江省水稻生产的低温冷害问题,研究OsPHD17调控水稻耐冷性的功能和育种潜力,为提高水稻耐冷性,保障黑龙江水稻高产、稳产提供理论指导。
2. 本项目具有较高的创新性。目前研究多集中于PHD蛋白参与植物生长发育的调控,对其参与耐逆相关研究较少,OsPHD17作为水稻PHD家族中唯一一个响应冷胁迫的成员,目前尚未有研究报道其功能;此外,OsPHD17是水稻物种特异miR1320的靶基因,而miR1320已被证实在水稻耐冷应答中发挥重要作用,因此,本项目重点关注OsPHD17在水稻耐冷反应中的功能及育种价值。
1. 技术路线
2. 拟解决的关键问题
通过本研究,将明确OsPHD17在调控水稻耐冷性的功能及其育种潜力,获得具有自主知识产权、耐冷功能明确的关键基因,为水稻耐冷分子育种提供精确靶点。
3. 预期成果
通过本研究,将发表学术论文1篇,提交结题报告1份。
2022年6月-2022年9月:完成OsPHD17转基因水稻萌发期、幼苗期耐冷性分析。
2022年10月-2022年12月:完成OsPHD17转基因水稻孕穗期耐冷性分析、生育期调查和农艺性状分析。
2023年1月-2023年3月:完成OsPHD17转基因水稻产量性状分析。
2023年4月-2022年6月:完成OsPHD17调控冷胁迫的生理应答途径分析。
1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
项目申请人所在课题组长期以来重点关注寒地水稻耐低温的关键基因挖掘、功能鉴定、分子机制解析及育种研究。
在前期研究中,对水稻PHD家族进行了系统分析,发现59个家族成员中OsPHD17对冷胁迫响应最显著。相关研究已发表在中科院二区SCI期刊International Journal of Molecular Sciences。
与本项目密切相关的前期研究工作简述如下:
(1)对水稻PHD家族分析发现,59个家族成员中OsPHD17对冷胁迫响应最显著。
图1 OsPHD17对冷胁迫响应最显著
(2)qRT-PCR证实了OsPHD17表达受冷胁迫显著诱导。
图2 OsPHD17冷胁迫表达模式qRT-PCR分析
(3)通过水稻遗传转化和分子生物学鉴定,分别获得了OsPHD17超量表达和基因敲除的转基因水稻株系。
图3 OsPHD17过表达转基因水稻的分子生物学鉴定
图4 OsPHD17基因敲除转基因水稻的分子生物学鉴定
(1)国内先进的研究平台。本项目依托课题组具备完善的分子生物学和植物生理学相关仪器设备,具备开展本研究的仪器设备和研究平台,能保障项目顺利实施。
开支科目 | 预算经费(元) | 主要用途 | 阶段下达经费计划(元) | |
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前半阶段 | 后半阶段 | |||
预算经费总额 | 50000.00 | 无 | 33000.00 | 17000.00 |
1. 业务费 | 15000.00 | 无 | 8000.00 | 7000.00 |
(1)计算、分析、测试费 | 5000.00 | 实验开展过程中的引物合成、测序等费用 | 3000.00 | 2000.00 |
(2)能源动力费 | 0.00 | 无 | 0.00 | 0.00 |
(3)会议、差旅费 | 5000.00 | 国内外术交流 | 5000.00 | 0.00 |
(4)文献检索费 | 0.00 | 无 | 0.00 | 0.00 |
(5)论文出版费 | 5000.00 | 发表论文所需的版面费 | 0.00 | 5000.00 |
2. 仪器设备购置费 | 0.00 | 无 | 0.00 | 0.00 |
3. 实验装置试制费 | 0.00 | 无 | 0.00 | 0.00 |
4. 材料费 | 35000.00 | 购买开展实验所需的各类试剂耗材等 | 25000.00 | 10000.00 |