转录因子GsbZIP67耐苏打盐碱功能解析

大豆（Glycine max [L.] Merr.）是我国重要的粮食兼油料作物，但我国的大豆产量难以满足国内需求。我国大豆产业存在两个问题：一是种植面积不足，二是大豆的亩产量不高。我国耕地面积有限，一直增加大豆种植面积会影响其他作物的产量。因此需要开发利用盐碱地，培育耐盐碱大豆品种对拓大豆种植面积、提高大豆产量和自给率具有重要意义。

本课题组长期致力于作物耐盐碱的分子应答机制研究。课题组前期从吉林白城重度盐碱区采集的345份野生大豆材料中，筛选获得了耐盐碱能力最强的株系G07256。以此为试材，已经获得多个耐盐碱功能显著的关键调控基因。为深入挖掘盐碱胁迫应答的分子调控机制，构建了野生大豆cDNA文库，通过含8 mM NaHCO₃的SD-Leu培养基筛选获得了1个野生大豆 S2类亚家族的bZIP转录因子bZIP67，并克隆GsbZIP67基因全长，进行了生物信息学分析，亚细胞定位的分析等。

为进一步解析bZIP67在苏打盐碱胁迫下的作用机制，基于前期研究基础，本项目拟通过分析转录激活活性、确定关键激活结构域区域及验证盐碱胁迫诱导表达，从而确定GsbZIP67基因表达特性；进一步利用毛状根系统从过表达和基因沉默2个角度，分析盐碱胁迫表型、生理指标及响应盐碱胁迫的基因表达，明确bZIP67的靶基因是否调控苏打盐碱耐性，进而解析bZIP67参与大豆对苏打盐碱胁迫应答的调控作用。为完善大豆bZIP转录因子逆境应答分子机制具有重要理论价值，为耐盐碱大豆分子设计育种提供基因资源和理论指导。

本课题组前期研究表明bZIP67是一个bZIP S2类亚家族转录因子且定位在细胞核。为进一步解析bZIP67如何参与植物耐盐碱胁迫的分子机制，本项目将解析bZIP67参与苏打盐碱胁迫应答的分子机制，以期为大豆耐逆分子机制提供理论基础。具体研究内容如下：

2.1 bZIP67转录因子表达特性分析

2.1.1转录激活活性分析：构建PCAMBIA3301-bZIP67表达载体，再将3个G-box元件构建到PXGUS-P载体上，共转化拟南芥原生质体，利用共聚焦显微镜观察原生质体的荧光情况，确定转录激活活性。

2.1.2转录激活结构域的确定：将bZIP67编码区分段，分别构建功能结构域缺失的BD-bZIP67t（truncated）酵母表达载体，采用PEG/LiAc法转化酵母AH109菌株，分析重组酵母菌的生长情况，确定转录激活结构域具体区域。

2.1.3盐碱胁迫表达模式分析：21日龄的野生大豆幼苗，分别培养在200 mM NaCl和50 mM NaHCO₃（pH=8.5）中，提取处理后第0、1、3、6、12、24 h根部RNA，采用qRT-PCR分析其盐碱胁迫表达模式。

2.2 bZIP67耐苏打盐碱功能分析

2.2.1大豆毛状根的获得：采用发根农杆菌介导法侵染大豆，通过PCR检测以及Bar蛋白检测，鉴定获得bZIP67-OE及bZIP67-RNAi的大豆毛状根。

2.2.2苏打盐碱胁迫表型及生理指标测定：对比正常培养的长势一致的空载体、bZIP67-OE及bZIP67-RNAi大豆毛状根在苏打盐碱胁迫处理下的表型及形态、NBT及DAB染色、活性氧清除系统酶活、离子渗漏等指标，确定其在苏打盐碱胁迫应答中的功能。

2.2.3 苏打盐碱胁迫响应相关基因的表达分析：设计NAPD-ME，KIN1，H+ATpase，RD29A等响应相关基因的定量引物，利用qRT-PCR检测长势一致的空载体、bZIP67-OE及bZIP67-RNAi大豆毛状根中响应基因表达水平。

3.1 植物响应盐碱胁迫的机理研究

由于土壤的盐化与碱化往往伴随着发生，因此人们经常将土壤可溶性盐分的增加统称为“土壤盐碱化”^[1]。盐胁迫主要由中性盐如NaCl、Na₂SO₄ 造成，而碱胁迫主要由碱性盐，如碳酸氢盐( HCO₃^- )和碳酸盐(CO₃^2-)造成。盐胁迫对植物产生的危害主要包括离子胁迫、渗透胁迫和氧化胁迫，碱胁迫在此基础上增加了由碳酸氢盐或碳酸盐导致的HCO₃或CO₂^3-离子胁迫及高pH胁迫。而盐碱胁迫会同时造成高盐和高pH值的损害，从而导致高pH值胁迫、离子毒害以及渗透胁迫^{[2, 3]}，可以进一步引起质膜损伤、代谢紊乱和营养吸收不良，严重阻碍作物的生长和发育，导致作物减产^[4]。盐碱胁迫使细胞内的渗透压超过细胞外的渗透压，从而破坏了植物体内的动态离子平衡。Na⁺/K⁺值是衡量植物耐盐碱能力的一个重要依据。高pH值破坏了离子平衡，抑制Na⁺的排出，对植物造成损害^[2]。而高pH值胁迫主要作用于植物的根系，使其组织结构受到损伤，从而导致根系细胞失去正常的生理功能^{[5, 6]}。Wittyngham(2020)发现植物的Na⁺含量随着土壤盐度的增加而明显增加，而K⁺含量则明显下降^[7]。在植物中，蛋白激酶，如钙依赖蛋白激酶（CDPKs）、丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）级联信号途径和类受体蛋白激酶（RLKs）在应对非生物胁迫中起重要作用，而这些信号途径作用于各种下游转录因子，随后激活下游的盐碱响应基因^[8]。盐碱胁迫可以产生自由基或非自由基形式的活性氧（ROS），过多的ROS会对植物的蛋白质、脂质、核酸和质膜造成氧化损伤^[9-11]。因此，ROS清除系统是植物应对盐碱胁迫的一个重要手段。Jia等人（2019）^[12]发现，盐碱胁迫可以激活植物的ROS消除系统，同时上调与氧化有关的各种蛋白质的表达。关于植物的光合细胞，叶绿体对盐碱胁迫很敏感，Na⁺的过度积累会导致二氧化碳通过气孔和间叶扩散，从而破坏光合作用^[13]。在一项关于水稻的耐受性的研究中。在盐碱胁迫下，轻度胁迫对叶绿体的结构没有明显的影响，而中度和重度胁迫则降低了叶绿素的含量，改变了叶绿体的颗粒，并造成不同的影响，导致不同程度的叶绿体膜瓦解^{[14, 15]}。植物对盐碱胁迫反应的信号转导途径和代谢机制已经有了一定的研究。例如，F-box Triple LRR（FTL）蛋白，它可以识别多种目标基因，参与了许多生命过程，包括对盐胁迫的反应^[16]。然而，在分子、细胞和代谢水平上，复杂的抗盐碱途径的调控网络还没有被系统和全面地阐述。

目前大部分研究多关注中性盐胁迫，对苏打盐碱逆境的研究鲜有报道。而我国东北及内陆地区主要的盐碱土壤是苏打盐碱土，除了中性盐引发的离子毒害、渗透胁迫外，还有碳酸盐和高pH胁迫，情况更复杂，对作物生长和产量影响更大。

3.2大豆耐盐碱关键基因挖掘的研究进展

在大豆耐盐基因发掘研究中，研究人员通过正向遗传学和反向遗传学两种途径鉴定出一批提高大豆耐盐能力的基因或位点^[17]。过去几十年来，利用构建重组家系的连锁分析对大豆耐盐性状进行了大量研究。而近年来，研究人员利用重测序和表型鉴定联合分析的全基因组关联分析技术研究大豆种质耐盐性状，通过定位大豆耐盐数量性状位点（quantitative trait locus, QTL），对主效QTL进行精细定位，鉴定耐盐相关基因。通过多年研究，科研人员已鉴定了多个调控大豆耐盐碱性的关键基因，如通过精细定位鉴定到在3号染色体上的耐盐相关基因 GmSALT3^[18]；利用RIL 群体QTL定位、GWAS及重测序技术鉴定到在8号染色体上的耐盐性相关基因GmCDF1^[19]等。近年来，各类组学技术飞速发展，越来越多的基因被证实参与大豆盐碱胁迫应答过程，如GmDREB6^[20]、GmTGA26^[21]、GmbZIP2^[22]、GmNAC06^[23]。虽然现有研究已挖掘了很多大豆响应盐碱胁迫的相关基因^[24]，但大豆耐盐碱的分子机制还有待研究。

本团队针对苏打盐碱逆境，开展大豆耐苏打盐碱关键基因挖掘及应答机制解析工作。从300余份野生大豆品系中，筛选出一个苏打盐碱耐受性最高的品系G07256，利用高通量组学技术系统分析了野生大豆响应苏打盐碱胁迫的基因调控网络及代谢通路，鉴定出多个耐盐碱蛋白激酶和转录因子如GsERF71^[25]，Gshdz4^[26]等，初步建立了类受体激酶调控苏打盐碱应答的信号通路。

3.3 bZIP转录因子调控大豆耐逆的研究进展

转录因子（TFs）在植物耐盐碱应答中起着很关键的作用，它与目标基因启动子的特定区域结合以激活或抑制下游基因的表达^[27]。如图1所示，耐盐相关转录因子调控网络。

图1 耐盐相关转录因子调控网络 (引自王楠等^[28]，2016. Fig. 1 Regulatory net of salt stress tolerance related transcription factors (From Wang, et al. ^[28], 2016)

包括碱性亮氨酸拉链（bZIP）转录因子家族在内，在植物界已发现了60多个转录因子家族，bZIP转录因子通常包含由40-80个氨基酸组成的一个高度保守的bZIP结构域^[29]，该结构域包括一个高度保守的DNA识别结构域，一个保守程度较低的亮氨酸拉链元件，其特点是在连续的α-螺旋上^[30]。植物bZIP蛋白通常可通过与DNA元件结合调控下游相关基因表达。bZIP蛋白优先结合ACGT顺式作用元件，如A-box（TACGTA）、C-box（GACGTC）、G-box（CACGTG）及ABRE（CCACGTGG）^[31]。

到目前为止，在拟南芥中已经鉴定了78个bZIPs转录因子，分为13个亚家族（A-L，S）^[32]，不同亚族分别行使不同的功能，包括参与逆境胁迫、种子发育、病菌防御、光信号转导、调控维管发育、组织分化、细胞生长、糖代谢等多个生物过程^[33]。其中，A亚族主要介导ABA和逆境胁迫的调控表达，C亚族主要参与种子发育和病菌防御，D亚族参与病害防御和生理生长，G亚族参与光信号调控，H亚族在光合作用过程中起关键作用，S亚族在各种非生物胁迫下可以激活转录调控^[34]。

在大豆中发现了352个bZIP转录因子^[35]，其中研究发现有31个基因受盐胁迫诱导表达^[36]。但关于大豆bZIPs转录因子在逆境应答中的作用机制研究相对较少，且大多数只在拟南芥受体中研究基因的盐胁迫功能（表1）。

表1 大豆中bZIP转录因子家族耐盐相关基因

Table 1 Salt tolerance-related genes in the bZIP transcription factor family in soybean

可见，大豆bZIP家族耐逆，尤其是耐苏打盐碱功能的相关研究报道非常少，亟需对该家族基因的耐逆功能及分子调控机制进行深入研究。此外，多数研究只验证了大豆bZIP转录因子受盐诱导表达，具有正、负调控盐胁迫的功能，其逆境应答调控机制研究报道并不多，也并未鉴定出直接调控的下游基因。因此，本项目在团队前期基础上进一步解析bZIP67在苏打盐碱胁迫下的作用机制。通过本项目研究对揭示大豆bZIP转录因子调控的靶基因，解析bZIPs在苏打盐碱应答过程中的作用机制，完善bZIP逆境应答分子机制具有重要意义，将为大豆耐盐碱胁迫奠定重要基础，为大豆耐盐碱胁迫分子育种提供基因资源。

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目前对植物耐盐碱的研究多关注盐胁迫对面积更大、危害更严重的苏打盐碱复合型胁迫研究较少。而我国东北及内陆地区主要的盐碱土壤是苏打盐碱土，除了中性盐引发的离子毒害、渗透胁迫外，还有碳酸盐和高 pH 胁迫，情况更为复杂，对作物生长和产量影响更大。本项目以前期自主筛选的耐苏打盐碱能力极强的野生大豆材料G07256 为试验材料，以一个耐苏打盐碱功能显著的野生大豆转录因子 bZIP67为切入点，探究 bZIP67参与大豆耐苏打盐碱性的分子机制，为创制耐盐碱大豆新材料，开发利用盐碱地提供理论指导。

虽然bZIP家族转录因子参与不同的生物学过程，但目前尚未有大豆bZIP S2亚家族成员的逆境胁迫的分子机制相关报道。本项目将为解析大豆耐盐碱分子机制奠定坚实基础及为大豆bZIP家族研究提供新思路。

5.1 技术路线（红色实线内容为课题组前期已完成部分）

5.2拟解决的关键问题

通过本研究，将明确GsbZIP67在调控大豆耐苏打盐碱的功能及其育种潜力，获得具有自主知识产权、耐盐碱功能明确的关键基因，为大豆耐盐碱的分子育种提供理论基础。

5.3 预期成果

通过本研究，将发表学术论文1篇，提交结题报告1份。

2022年6月-2022年12月：完成转录激活活性分析；转录激活结构域分析；盐碱胁迫表达模式分析。

2023年1月-2023年3月：完成毛状根盐碱胁迫表型，生理指标分析。

  2023年4月-2023年6月：完成盐碱胁迫响应基因的表达分析，完成结题报告撰写。