肠道是畜禽最大的消化器官，也是重要的免疫器官。肠道黏膜是畜禽肠道与营养物质、微生物以及外来病原直接接触的肠道表皮，肠道黏膜屏障由物理屏障、化学屏障、免疫屏障以及微生物屏障共同构成，肠道的四大屏障共同完整性地维持动物体肠道的稳态以及机体的健康[1-3]。其中，肠黏膜免疫屏障是机体抗病首道防线，由肠道相关淋巴样组 织（GALT）、分泌型抗体、肠系膜淋巴结（ETC）构成，GALT可产生IgA，IgA可与抗原物质形成IgA抗原复合物。后者能与Ｍ细胞上的受体结合，抗原被转移到固有层,然后呈递给树突状细胞[4, 5]。肠黏膜免疫屏障功能损伤后通透性增加，小肠上皮细胞形态和功能发生改变，降低了肠道绒毛高度，加深了肠道隐窝深度，使肠道形态损伤，从而严重影响畜禽肠道的消化吸收功能，直接影响畜禽的生长性能，使畜禽养殖业受到极大损失。
近年研究发现，肠道黏膜区域免疫系统，包括固有层、派伊尔氏结和肠系膜淋巴结中定居的免疫细胞群体与外周免疫器官中对应的免疫细胞差异显著[6-8]；除有大量负向免疫调节功能的调节性Ｔ淋巴细胞定居外，肠道区域内的DCs细胞也表现出与外周免疫器官中DCs细胞明显不同的表型与功能，呈现出其独特的肠道区域DCs细胞亚群特性。黏膜部位的DCs主要是外周血中的单核细胞进入到肠道黏膜部位分化而来[9, 10]。当病原侵入黏膜部位时，黏膜部位DCs快速识别、摄取、加工处理病原，然后呈递给Ｔ淋巴细胞，并诱导Ｔ淋巴细胞活化、分化为效应细胞，进而清除病原[11, 12]。肠道DCs遍布于固有层绒毛、肠道淋巴组织如派氏结PP、孤立淋巴组织、肠系膜淋巴结，在摄取、处理并将肠腔和外周自身抗原呈递给Ｔ淋巴细胞的过程中起着至关重要的作用。
随着免疫学研究的快速发展，经典的Th1/Th2构架失衡理论在炎症性疾病中的作用不断受到新的学说与理论的挑战。人们发现增强Th1应答并不能减轻Th2介导的变应性炎症反应。这表明免疫系统损伤的发病机制不能简单的归咎于Th1/Th2的比例失调，而很可能存在更为复杂的机制在其发病过程中扮演着重要角色[13, 14]。Th17细胞是独立于Th1 和Th2细胞之外的第三类效应T细胞亚群，参与了机体炎症反应与自身免疫性疾病的调节。Treg细胞具有免疫抑制和免疫调节两大功能，是维持机体自身免疫耐受的重要组成部分[15, 16]。在对抗过敏原时，在平衡免疫反应以维持外周耐受中发挥关键作用。它们可以抑制以Th1或Th2为表型的炎症反应中的效应T细胞[17, 18]。Th17细胞和Treg细胞在功能上相互拮抗，保持动态平衡，维持机体免疫状态的相对稳定。当Th17细胞与Treg细胞之间的平衡被打破，会引起肠黏膜免疫功能紊乱。
我国是天然植物资源最丰富的国家，同时中医理论历史悠久，尤其近年来，天然来源的药物研发发展迅速，因其疗效确切、不易产生耐药性等优势更是成为国内外开发新药的理想选择。大黄酚（Chrysophanol），是从中药大黄的根中提取的一种蒽醌类化合物，橙黄色片状体、金黄色六方形片晶或单斜形结晶，分子式为C15H10O4，分子质量为254.23。大黄酚不溶于水，极微溶于石油醚，略溶于冷乙醇，易溶于沸乙醇，溶于氯仿、苯、乙醚、丙酮，冰醋酸等[19, 20]。目前药理作用研究发现，大黄酚对肺炎球菌、甲型链球菌、幽门螺杆菌等多种细菌有抑制作用；能够通过提高SOD活性，清除氧自由基，改善学习记忆障碍的作用；通过抑制脑过氧化脂质生成，发挥抗衰老的作用；抑制炎性细胞因子分泌治疗小胶质细胞介导的神经炎症，还具有促进止血、使肌肉麻痹、促进神经兴奋等作用，但大黄酚对免疫系统作用的研究却未见报道[21-24]。本实验室在前期免疫调节药物的筛选中发现，大黄酚具有潜在的免疫增强作用。但大黄酚性质不稳定，见光易氧化分解，并且对胃有刺激作用，因此限制了其基础研究和临床应用。
纳米粒作为药物递送系统，可增加药物在溶剂中的溶解度，促进药物吸收，提高药物生物利用度，改变药物动力学性质，有效减少用药量和降低药物的毒副作用，同时纳米粒容易穿过组织间隙，在组织和细胞中长期驻留并缓慢释放药物。聚乳酸－轻基乙酸共聚物（PLGA）也称聚乙丙交酯，PLGA有着良好的生物相容性和安全性还具有很好的稳定性，PLGA纳米粒具有易于被吞噬细胞摄取，通过在颗粒表面吸附相应的配体可定位到特定的组织或器官等优点，现已被美国食品药品管理局批准为药用辅料[25-28]。目前已有多种药物以PLGA为骨架制备成生物可降解微球，用于药物的缓释和控释，因此已被广泛应用于临床医学的方方面面。PLGA载药微球释放药物可分为三个阶段，首先是由扩散控制的突然释放，第二阶段药物的扩散释放由于纳米粒的溶蚀而发生，最后是由于纳米粒降解和药物扩散而发生的第二次突然释放。其控释机制在于，当药物包载于PLGA后，纳米粒在降解过程中，其表面会形成微孔，使得药物从纳米粒微孔中逐渐释出[29-30]。PLGA纳米粒的特色是可以在数周乃至数月时间内以一定速率释放药物，维持有效的血药浓度，减少给药次数，减少用药量，提高疗效以及提高机体顺应性等。因此，PLGA纳米控释和缓释系统尤其适用于大黄酚等这类半衰期比较短或生物利用度较低的药物。
本研究利用PLGA纳米粒的载药作用，采用乳化-溶剂挥发法，将大黄酚制备成新型免疫增强剂，即大黄酚-PLGA纳米粒，增加其生物利用度，并在优选出的最佳制备工艺条件基础上，制备大黄酚-PLGA纳米粒用于体内试验。在试验中，我们建立了CTX诱导的肠黏膜免疫屏障损伤小鼠为模式动物，依据成熟DCs表面特征因子，通过测定肠道组织形态、肠黏膜免疫细胞因子、肠上皮细胞粘附连接蛋白、紧密连接蛋白和免疫相关基因表达量等，并借助相关信号转导通路平台，筛选产生效用靶点，阐明大黄酚通过调控调节Th17/Treg平衡对肠黏膜免疫屏障的免疫保护机制，为大黄酚-PLGA纳米粒作为新型中兽药免疫增强剂的开发和应用提供了理论指导。
参考文献
[1] 戴伟, 吴海兰, 赵明, 等. COPD大鼠肠粘膜屏障功能障碍的观察研究[J]. 肠外与肠内营养, 2022, 29(01): 18-23.
[2] Camilleri M, Lyle B J, Madsen K L, et al. Role for diet in normal gut barrier function: developing guidance within the framework of food-labeling regulations. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2019, 317(1): G17-G39.
[3] Coufal S, Galanova N, Bajer L Y, et al. Inflammatory Bowel Disease Types Differ in Markers of Inflammation, Gut Barrier and in Specific Anti-Bacterial Response. Cells. 2019 , 8(7): 719.
[4] Cai Z, Zhang W, Li M, et al. TGF-beta1 gene-modified, immature dendritic cells delay the development of inflammatory bowel disease by inducing CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells. Cell Mol Immunol. 2010 , 7(1): 35-43.
[5] 杨悦杰, 郑荣秀, 李颖, 等. 肠道病毒71型感染鼠树突状细胞后基因表达谱的变化及内吞途径分析[J].中华传染病杂志, 2020, 38(6): 363-368.
[6] 彭众. 早期断奶对树突状细胞介导的仔猪肠道黏膜免疫功能的影响及精氨酸对其的调节作用[D]. 扬州大学, 2019.
[10] Murakami K, Sasaki H, Nishiyama A, et al. A RUNX–CBFβ-driven enhancer directs the Irf8 dose-dependent lineage choice between DCs and monocytes[J]. Nature Immunology, 2021, 22(3): 1-13.
[11] Han F, Guo H, Wang L, et al. TSLP Produced by Aspergillus fumigatus-Stimulated DCs Promotes a Th17 Response Through the JAK/STAT Signaling Pathway in Fungal Keratitis.[J]. Investigative ophthalmology & visual science, 2020, 61(14): 24-28.
[12] 周文旭, 吴晓燕, 施秉银, 等. BALB/C小鼠骨髓源性树突状细胞的定向诱导分化及鉴定[J]. 西安交通大学学报(医学版), 2021, 42(02): 219-224.
[13] 许年凤, 章小华, 白露, 等. 肝硬化超声影像特点与患者肠黏膜炎性因子和Th1/Th2变化的关联[J]. 河北医药, 2020, 42(11): 1661-1664.
[14] 崔银雪. 致病性E.coli O1对犊牛肠黏膜免疫屏障及肠道菌群的影响[D]. 内蒙古农业大学, 2020.
[15] 解莹. 酪酸梭菌通过TLR2/MyD88/NF-κB信号通路调控Th17细胞治疗炎症性肠病的免疫机制研究[D]. 中国医科大学, 2020.
[16] 杨默媛, 安泽, 孙宇涵, 等. 枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊联合泮托拉唑对UC患者炎性因子、肠黏膜功能及外周血Th17、CD4+CD25+ Treg细胞表达的影响[J]. 现代生物医学进展, 2020, 20(20): 3965-3968+3906.
[17] 吴佳佳. “从肠论治”对过敏性哮喘小鼠肺肠Th17/Treg及肠道菌群的影响[D]. 北京中医药大学, 2017.
[18] 丁秀丽. 基于Treg/Th17细胞失衡探讨清温并用法对慢加亚急性肝衰竭肠源性内毒素血症大鼠肠黏膜炎症反应的调控[D]. 湖南中医药大学, 2018.
[19] Prateeksha, Yusuf M A, Singh B N, et al. Chrysophanol: A Natural Anthraquinone with Multifaceted Biotherapeutic Potential. Biomolecules. 2019, 9(2): 68.
[20] Chang S J, Huang S H, Lin Y J, et al. Antiviral activity of Rheum palmatum methanol extract and chrysophanol against Japanese encephalitis virus[J]. Archives of Pharmacal Research, 2014, 37(9): 1117-23.
[21] Lee H S, Jeong G S. Chrysophanol Attenuates Manifestations of Immune Bowel Diseases by Regulation of Colorectal Cells and T Cells Activation In Vivo. Molecules. 2021, 26(6): 1682.
[22] Lin F L, Lin C H, Ho J D, et al. The natural retinoprotectant chrysophanol attenuated photoreceptor cell apoptosis in an N-methyl-N-nitrosourea-induced mouse model of retinal degenaration[J]. Scientific Reports, 2017, 7: 41086.
[23] Lian Y, Xia X, Zhao H, et al. The potential of chrysophanol in protecting against high fat-induced cardiac injury through Nrf2-regulated anti-inflammation, anti-oxidant and anti-fibrosis in Nrf2 knockout mice[J]. Retour Au Numéro, 2017, 93: 1175-1189.
[24] 安畅, 张颖, 马阮昕, 等. 半夏有效成分大黄酚对肿瘤坏死因子-α诱导人脑微血管内皮细胞的作用机制[J]. 中国实验方剂学杂志, 2018, 24(3): 160-165.
[25] Lu B, Lv X, Le Y. Chitosan-Modified PLGA Nanoparticles for Control-Released Drug Delivery. Polymers (Basel). 2019, 11(2): 304.
[26] Lagreca E, Onesto V, Di Natale C, et al. Recent advances in the formulation of PLGA microparticles for controlled drug delivery. Prog Biomater. 2020, 9(4): 153-174.
[27] Park K, Skidmore S, Hadar J, et al. Injectable, long-acting PLGA formulations: Analyzing PLGA and understanding microparticle formation. J Control Release. 2019, 304: 125-134.
[28] 沈俊楠, 姚文栋. 载白藜芦醇PLGA纳米粒的制备及其体内外评价[J].中国现代应用药学, 2021, 38(2): 167-172.
[29] Mahmood R, Masoud K A, Hamid R B, et al. In vitro bioactivity and corrosion of PLGA/hardystonite composite-coated magnesium-based nanocomposite for implant applications[J]. International Journal of Minerals Metallurgy and Materials, 2021, 28(1): 168-178.
[30] 张晓千, 梁丽娜, 付金芳, 等. 厚朴酚PLGA纳米粒的制备及其体内药动学研究[J]. 中成药, 2020, 42(10): 2550-2555.
