笔杆检测报告单（全文标明引文）

大学生创新训练项目计划申请书

项目编号

项目名称 AMEP412基因对大豆耐盐碱性的探究

项目负责人邢晓琳联系电话18835229482

所在学院生命科学技术学院

学号20214081343专业班级21级生物技术一班

指导教师陈男

申请日期

起止年月

黑龙江八一农垦大学

一、基本情况

项目名称 AMEP412基因对大豆耐盐碱性的探究

项目级别省级

项目类型创新训练项目

项目类别

所属学科学科一级门:理学学科二级类:生物科学类

是否为重点支持领域是/√否重点支持领域泛终端芯片及操作系统、重大应用软件的应用开发;云计算、人工智能和无人驾驶;新材料及制造技术;新能源与储能技术;生物技术与生物育种;绿色环保与固废资源化;新一代通信技术、千兆光网技术和新一代IP网络通信技术;生物医学工程与精准医学、脑科学和类脑计算;城乡治理与乡村振兴;社会事业与文化传承

项目来源名称 A学生自主选题,来源自己对课题的长期积累与兴趣;B√学生来源于教师科研项目选题;C学生承担社会、企业委托项目选题;D拔尖专项;E竞赛专项;F研修专项

选题来源新工科、新医科、新农科、新文科,菜单选填

起止年月2024年9月到2025年12月

负责人邢晓琳性别女民族汉出生年月2002年03月

学号20214081343联系电话宅:

手机:18835229482邮箱:1723922279@qq.com

指导教师陈男联系电话宅:

手机:19825293559职称:初级邮箱:1441962306@qq.com

项目简介本研究团队从生防菌贝莱斯芽孢杆菌BU396中分离鉴定得到一种全新功能的AMEP蛋白,通过探究该蛋白,发现其有激活植物免疫,提高植物抗性的功能。为探究其基因功能,课题组前期克隆了 AMEP 蛋白编码基因 AMEP412,并将该基因通过毛状根介导转至大豆中,获得了转AMEP412基因大豆毛状根复合体植株,验证了该基因可在大豆发根中表达,并能够增强大豆的耐盐碱能力。本项目计划将AMEP412基因通过根癌农杆菌介导大豆子叶节的方法完成大豆的遗传转化,并进行无菌培养,获得转基因大豆植株,通过盐碱胁迫来进一步探究该基因过表达对大豆的耐盐碱能力的影响,未来可用于培养转基因耐盐碱大豆作物的研究。

负责人曾经参与科研的情况参与AMEP蛋白功能开发研究;参与AMEP412基因功能的研究;参加互联网+大赛。

指导教师承担科研课题情况黑龙江省教育厅,黑龙江省高校学科协同创新建设项目(孵化专项),2042070001, AMEP植物疫苗的规模化生产与商业运营,2023-01至今,50万元,在研,参与

指导教师对本项目的支持情况每月组织交流会,为AMEP412转基因大豆遗传体系的建立提供理论和技术指导。

项目组主要成员姓名学号专业班级所在学院项目中的分工

邢晓琳2021408134321级生物技术一班生命科学技术学院项目运行及项目负责人

温碧霞2021408134021级生物技术一班生命科学技术学院大豆遗传体系的建立

王雪艳20234083022123级生物科学二班生命科学技术学院转基因大豆的培养

韩馨慧20234083023623生物科学二班生命科学技术学院转基因大豆生理指标的检测

肖垌20234083023723级生物科学二班生命科学技术学院荧光定量分析

二、立项依据(可加页)

(一)研究目的

本研究团队从生防菌贝莱斯芽孢杆菌BU396中分离鉴定得到一种全新功能的AMEP蛋白,通过探究该蛋白,发现其有激活植物免疫,提高植物抗性的功能。为探究其基因功能,课题组前期克隆了 AMEP 蛋白编码基因AMEP412,并将该基因通过毛状根介导转至大豆中,获得了转AMEP412基因大豆毛状根复合体植株,验证了该基因可在大豆发根中表达,并能够增强大豆的耐盐碱能力。

本项目计划将AMEP412基因通过根癌农杆菌介导大豆子叶节的方法完成大豆的遗传转化,并进行无菌培养,获得转基因大豆植株,通过盐碱胁迫来进一步探究该基因过表达对大豆的耐盐碱能力的影响,未来可用于培养转基因耐盐碱大豆作物的研究。

研究内容

1、根癌农杆菌的转化

将实验室前期构建的植物表达载体pPHG-AMEP412通过冻融法转化到根癌农杆菌中,并通过筛选鉴定阳性菌株,为后续遗传转化做准备

2、大豆的遗传转化

选取不具有耐盐碱性,且遗传转化体系成熟的大豆品种"williams"作为受体材料,根据实验室前期研究,采用根癌农杆菌介导大豆子叶节的方法完成大豆的遗传转化,并进行无菌苗的培养。

3、转基因大豆的鉴定

待无菌苗出根时间20d左右,待长出健壮的根系的大豆移栽到室外营养土中,取移栽后成活的再生苗进行阳性苗的筛选与鉴定。

大豆的盐碱胁迫处理

将转基因大豆置于23℃的温室进行培养至三复叶期,用NaHCO3溶液作为盐胁迫处理液对植株进行浇灌,对照组只浇灌水。同时对同一生育期的野生型大豆进行相同处理,作为野生型对照组。

生理检测

记录盐碱胁迫下的转基因大豆与野生大豆的表型变化,并取样进行光合测定、生理检测,MDA、脯氨酸、CAT、SOD、POD等

荧光实时定量PCR

利用荧光实时定量PCR对转基因植株及野生型植株中抗逆应激基因的表达水平进行检测,通过转基因植株和同一处理条件下的野生型植株相对表达量的比较。分析所有抗逆应激基因对盐碱胁迫均有程度的不同响应。

国、内外研究现状和发展动态

大豆(Glycine max(L.)Merr.)是一种重要的豆类作物,全球产量超过3.33亿吨。大豆种子富含必需氨基酸、蛋白质(40%)、脂质和代谢物(异黄酮和皂苷),占世界食用油消费量的56%[1]。尽管大豆非常重要,但从发芽到最终收获,田间种植的大豆面临着巨大的环境挑战。在这些环境挑战中,全球土壤盐碱化对包括大豆在内的经济作物来说是日益严重的问题[2]。根据目前的估计,全球约有10亿公顷(约19.5%的农田)受到盐的影响[3]。在中国,超过1亿公顷的土地受到盐碱胁迫[4]。在未来,可持续的粮食供应将是一个严峻的任务,以养活到2050年的90亿人口[5]。因此,培育高产、优质、耐盐碱胁迫的大豆品种,保障世界粮食安全仍是一项艰巨的任务。

大豆种植在热带、亚热带和温带气候地区。土壤盐碱化对大豆种子萌发、生长和发育阶段都有一定的影响。高盐浓度会对大豆造成高渗透胁迫、水分流失、体内平衡和离子失衡等危害。在形态上,盐碱胁迫下的大豆植株表现为叶片萎黄、坏死和烧焦[6]。盐碱胁迫通过降低根瘤数量和生物量来影响固氮效率。土壤盐度超过5 dS/m对大豆产量影响显著。盐碱胁迫降低了成熟大豆种子游离氨基酸、蛋白质、蔗糖和淀粉含量的质量和数量[7]。在盐碱胁迫下,脯氨酸、褪黑素(n -乙酰-5-甲氧基色胺)、甜菜碱(GB)和不同糖具有渗透保护作用,并在大豆中大量积累。例如,大豆品种积累更多的脯氨酸含量来修复盐胁迫的损害。然而,脯氨酸发挥的渗透保护作用在很大程度上取决于植物的生长发育阶段、盐胁迫的浓度和持续时间[8]。褪黑素是一种多效性信号分子,可通过促进大豆发芽、生长发育、解毒ROS、调节胁迫应答基因等途径缓解盐胁迫的不良影响。

在植物中,为了确定特定基因在大豆耐盐性中的作用,基因功能验证是必要的。由于大豆基因组结构高度复杂,近20年来大豆遗传转化进展缓慢且效率低下。因此,功能基因验证主要在拟南芥中进行,或在大豆毛根中表达。几种大豆遗传转化方案的成功率不同,如未成熟的子叶、下胚轴、茎分生组织、胚胎、半种子和子叶节[9]大豆农杆菌介导的子叶结转化的平均转化效率为3.8%-8.7%[10]。最近有研究报道大豆的平均转化效率可达18.7%,但仍低于水稻和玉米[11]。多种因素综合影响大豆转化效率,包括品种、农杆菌培养基浓度、激素水平、外植体共培养时间和外植体再生能力。与传统育种相比,转基因方法具有许多优点,包括持续时间短、有针对性的基因组修饰和性状改进。

AMEP412基因经生物信息学分析广布于芽孢杆菌属菌株中,其产物 AMEP 蛋白是一种全新的蛋白激发子,有激发植物自身免疫提高植物抗病能力的作用12]。研究显示,在大豆叶表面喷施 AMEP 蛋白,对大豆苗期的抗旱能力有提高作用[13-14]。张琦以转 AMEP412基因的拟南芥为实验材料,设置干旱胁迫,结果表明 AMEP412基因在拟南芥中过量表达,可提高拟南芥的耐旱能力,减少干旱胁迫带来的危害[15]。若 AMEP412基因对大豆耐盐碱能力有促进效果,可培育转 AMEP412基因的大豆品种,对提高我国大豆产量保障粮食安全、改善我国盐碱地现状有重要意义。

参考文献:

[1] Behera,S.,Long,Y.,Schmitz-Thom,I.,Wang,X.P.,Zhang,C.,Li,H.,et al.Two spatially and temporally distinct Ca(2+)signals convey arabidopsis thalianaresponses to k(+) deficiency.New Phytol.213,739-750.

[2] Zaid,A.,Mushtag,M.,and Wani,S.H."Interactions of phytohormones withabiotic stress factors under changing climate,"in Frontiers in Plant-Soil Interaction,edsT.Aftab and K.R.Hakeem(Amsterdam:Academic Press,Elsevier,Amsterdam:Netherland),221-236.

[3] Li,H.,Zhao,Q.,and Huang,H.Current states and challenges of salt-affected soil remediation by cyanobacteria.Sci.Total Environ.669,258-272.

[4] Cai,X.,Jia,B.,Sun,M.,and Sun,X.Insights into the regulation of wildsoybean tolerance to salt-alkaline stress.Front.Plant Sci.13,1-19.

[5] Zhou,Z.,Jiang,Y.,Wang,Z.,Gou,Z.,Lyu,J.,Li,W.,et al. Resequencing wild and cultivated accessions identifies genes related to domestication andimprovement in soybean.Nat.Biotechnol.33,408-414.

[6] Yufang G. Soybean pod coloration and yield loss.[J]. Nature food,2023,4(7):538-538.

[7] El Mahi,H.,Pérez-Hormaeche,J.,De Luca,A.,Villalta,I.,Espartero,J.,Gámez-Arjona,F.,et al.A critical role of sodiumflux via the plasma membrane Na(+)/H(+)exchanger SOS1 in the salt tolerance of rice.Plant Physiol.180,1046-1065.

[8] Mansour,M.M.F.,and Ali,E.F.Evaluation of proline functions in salineconditions.Phytochemistry 140,52-68.

[9] Zhang,M.,Liu,S.,Wang,Z.,Yuan,Y.,Zhang,Z.,Liang,Q.,et al.Progressin soybean functional genomics over the past decade.Plant Biotechnol.J.20,256-282.

[10] Li,S.,Cong,Y.,Liu,Y.,Wang,T.,Shuai,Q.,Chen,N.,et al.Optimization of agrobacterium-mediated transformation in soybean.Front.Plant Sci.8,246.

[11] Zhang,M.,Liu,S.,Wang,Z.,Yuan,Y.,Zhang,Z.,Liang,Q.,et al.Progressin soybean functional genomics over the past decade.Plant Biotechnol.J.20,256-282.

[12] Chilton M D,Tepfer D A,Petit A,et al.Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the hostplant root cells[J].Nature,1982,295(5848):432-434.

[13] Shen Y, Li J, Xiang J, Wang J, Yin K, Liu Q. Isolation and identification of a novel protein elicitor from a Bacillus subtilis strain BU412. AMB Express.2019 Jul 27;9(1):117.

[14]王思文.干旱胁迫下 AMEP 蛋白对大豆幼苗抗旱性的调控效应[D].黑龙江八一农垦大学,2024.

[15]张琦.枯草芽孢杆菌 AMEP412基因的过表达对拟南芥耐旱性的影响[D].黑龙江大学,2024.

创新点与项目特色

本研究的特色与创新之处在于通过根癌农杆菌介导将AMEP412基因转入大豆中,探究盐碱胁迫下转AMEP412基因大豆的生理指标,以及相关抗逆基因的表达模式。

技术路线、拟解决的问题及预期成果

技术路线

拟解决的问题

通过根癌农杆菌介导将AMEP412基因转入大豆中

(2)分析盐碱胁迫下的转AMEP412基因大豆表达模式,及相关抗逆基因的表达

预期成果

1、获得转基因AMEP412基因大豆植株

2、生成研究报告1份;

3、发表论文1-2篇。

项目研究进度安排

2024.09-2024.10根癌农杆菌的转化

2024.11-2024.12大豆的遗传转化

2025.01-2025.06无菌苗的培养及转基因大豆的筛选与鉴定

2025.08-2025.07盐碱胁迫及相关生理指标的测定荧光定量分析

2025.08-2025.12撰写总结报告

(七)已有基础

1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩

项目组前期克隆了AMEP412基因,并构建了pPHG-AMEP412植物表达载体根据实验室前期研究,获得AMEP412基因序列,据此序列用premier 5.0设计带有BamH1和Pst1酶切位点的引物,进行AMEP412基因扩增,选取pPHG植物表达载体,连接目的基因,获得重组质粒pPHG-AMEP412。

图1植物表达载体PHG图谱图2重组载体酶切鉴定

通过发根农杆菌介导将AMEP412基因转至大豆发根中,获得转基因大豆毛状根复合体植株,对阳性植株进行鉴定后测定株高、叶面积、叶绿素含量根长、根面积,生长指标检测等数据显示,转基因组均高于对照组,说明AMEP412基因可明显促进大豆的生长。

图3转基因大豆毛状根复合体图4大豆毛状根复合体阳性鉴定

对转基因组和对照组大豆进行盐碱胁迫,记录表型变化,并测定不同胁迫时间下的生理指标和基因表达量,结果显示,AMEP412基因在大豆中表达能够促进大豆植株整体的生长发育,减小盐碱胁迫对植株造成的损伤,提高大豆的耐盐碱能力。

图5大豆胁迫处理表型变化(左:转PHG空载体组;右:转AMEP412基因组)

图6大豆盐碱胁迫表达差异图7大豆复合体组织表达差异

盐碱胁迫后取根部样本,依据氮蓝四唑法、愈创木酚法、过氧化氢法等测定各时间点SOD、POD、CAT等酶活性。结果表明,AMEP412基因在大豆中表达能够促进大豆中抗氧化酶活性,进而提高大豆的耐盐碱能力。

图8 SOD活性变化图9 POD活性变化图10 CAT活性变化

2.已具备的条件,尚缺少的条件及解决方法。

已具备的条件:

本项目依托所在单位的大创实验室中心来完成。仪器设备齐全,具有本实验所需的关键仪器,如:超净工作台、定量PCR仪、高速离心机、DNA凝胶电泳仪、PCR仪、凝胶成像仪等,能够完成转基因大豆的培育和基因表达量的检测。

尚缺少的条件:转基因大豆无菌苗培养所需试剂及耗材。

三、经费预算

开支科目预算经费(元)主要用途阶段下达经费计划(元)

前半阶段后半阶段

预算经费总额

1.业务费

(1)计算、分析、测试费3000分子测试分析15001500

(2)能源动力费

(3)会议、差旅费

(4)文献检索费

(5)论文出版费2000发表论文所需的版面费2000

2.仪器设备购置费

3.实验装置试制费4000用于购买实验相关试剂耗材20002000

4.材料费1000毕业论文打印查重1000

学校批准经费10000

四、指导教师意见

导师(签章):

年 月 日

五、院系大学生创新创业训练计划专家组意见

专家组组长(签章):

年 月 日

六、学校大学生创新创业训练计划专家组意见

负责人(签章):

年 月 日

七、大学生创新创业训练计划领导小组审批意见

导师(签章):

年 月 日