参考文献
4、创新点与项目特色
(1)选用天然来源的药物橙皮素,相较于传统治疗ACD的药物有毒副作用低、价格低廉、易获取的优势。
(2)借助网络药理学平台,从动物、细胞、分子水平上阐明了橙皮素治疗ACD的潜在靶点和作用机制。
5、技术路线、拟解决的问题及预期成果
(1)技术路线
(2)拟解决的问题
①确证橙皮素对ACD小鼠模型的治疗作用。
②借助网络药理学平台预测作用靶点并进行验证,从分子水平上阐明橙皮素治疗ACD的作用机制。
(3)预期成果
①本项目通过建立变应性接触性皮炎小鼠模型,体内实验证实橙皮素对模型小鼠的治疗作用;
依托网络药理学资源,预测橙皮素治疗变应性接触性皮炎疾病的潜在治疗靶点和相关信号通路,分子对接验证药物小分子配体与靶点的结合活性;
体外通过检测橙皮素对T淋巴细胞的毒性作用、增殖作用、细胞因子的影响,Western blot验证橙皮素与疾病的网络药理学预测结果,进一步阐明橙皮素治疗变应性接触性皮炎的作用机制。
②学生通过自主查阅资料、自主选题来完成项目,能够促进其科研创新能力的进一步提升。
项目由21级和23级制药工程专业学生参与,其中2名学生依托本大创项目完成本科毕业论文,选题时间预计在2024年7月15日,开题时间预计于2024年9月1日,有助于推进毕业论文改革。
③论文研究结果发表中文论文1篇。
6、项目研究进度安排
2024.06-2024.07 使用DNFB诱导建立ACD小鼠模型;
2024.08-2024.10 检测橙皮素对模型小鼠耳廓肿胀度、胸腺指数和脾脏指数等指标的影响,确证橙皮素的治疗作用;
2024.11-2024.12 利用网络药理学和分子对接挖掘橙皮素对ACD疾病治疗的潜在靶点;
2025.01-2025.03 体外检测炎性因子分泌水平,
Western Blot法验证网络药理学的预测结果,确定作用靶点;
2025.04-2025.05 总结整理并分析数据,撰写结题报告。
7、已有基础
(1)与本项目有关的研究积累和已取得的成绩
① 前期通过体内预实验证实橙皮素有潜在的治疗ACD疾病的作用
结果如图1所示,使用DNFB刺激小鼠右耳后,小鼠的耳廓厚度明显增加,
与生理盐水组对比有显著性差异(P<0.01),说明ACD小鼠模型建立成功,
使用10 mg/kg的橙皮素后,耳廓肿胀程度显著减轻(P<0.01)
HE染色结果如图2所示,经DNFB刺激后的ACD组小鼠耳廓出现明显的水肿和炎症细胞浸润现象,橙皮素组能够明显减轻水肿和炎症细胞浸润。
图1 橙皮素对ACD小鼠耳廓肿胀程度的影响
注:图中***为两组之间显著性比较,P<0.001
图2 橙皮素对ACD小鼠耳廓组织病理状态的影响(200×)
注:A为生理盐水组、B为ACD模型组、C为橙皮素组
②药物及疾病相关靶点获取
在TCMSP等四个数据库中收集了共120个的橙皮素相关靶点,
去除重复靶点后并在Uniprot数据库中限定物种为人(Human)并且已验证(Reviewed)的条件下矫正基因名称,剩余62个基因,确定为橙皮素的相关靶点。
在TTD等四个数据库中收集ACD相关靶点共1608个,
去除重复靶点后并在Uniprot数据库中限定物种为人(Human)并且已验证(Reviewed)的条件下矫正基因名称,剩余1544个基因,确定为ACD的相关靶点。结果见图3。
图3 橙皮素和ACD交集靶点
③ PPI网络构建及关键靶点的筛选
使用Venny 2.1平台获得橙皮素-ACD交集靶点共38个,并制作韦恩图,见图4。
使用STRING数据库建立PPI的网络,共包括38个节点,190条边。
将结果导入Cytoscape 3.9.1进行可视化分析,见图4,靶点的形状越大,颜色越深,说明Degree值越大,靶点在网络中越重要。
排名前七的基因分别是SCR、MMP9、BCL2、ESR1、PPARG、MMP2、KDR。
图4 橙皮素治疗ACD靶点蛋白互作网络图
④GO和KEGG通路富集分析
应用David数据平台对橙皮素-ACD共同靶点进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析。
由GO富集结果可知,BP条目主要包括细胞外基质分解(extracellular
matrix disassembly)、蛋白激酶 B
信号转导的积极调控(positivite regulation
of protein kinase B signaling)等;
CC条目主要包括质膜(plasma membrane)、细胞外空间(extracellular space)等;
MF条目主要包括酶结合(enzyme binding)、锌离子结合(zinc ion binding)等。
根据P值分别筛选处排名前5的GO富集分析结果,使用微生信在线平台采用数据可视化处理,见图5。
图5?橙皮素治疗ACD相关靶点的GO富集分析
由KEGG富集分析结果显示,共得到60条通路,将富集程度最高的前12条通路,使用微生信在线平台进行可视化,见图6。
横坐标代表Enrichment,颜色趋于红色,说明P值越大,点的面积越大,说明富集在此条通路上的基因靶点越多。
由图5可知,富集程度较高且与银屑病相关的通路包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Rap1信号通路等,见图6。
图6 橙皮素治疗ACD相关靶点的KEGG富集分析
(2)已具备的条件,尚缺少的条件及解决方法
①?已具备的条件
研究可依托学院实验室和生物技术中心实验室提供实验设备,
主要仪器和设备有:流式细胞仪、超低温冰箱、高速低温离心机、切片机、CO2培养箱、PCR扩增仪、倒置生物显微镜、多功能显微镜、凝胶成像系统、酶标仪、超声粉碎仪、水平电泳和垂直电泳装置、超净工作台、超纯水
系统等,
计算机联网等及分子生物学分析所需的软件,如用于PCR引物设计的软件Primer designer,
用于分析蛋白表达量的凝胶分析软件Band Scan,
用于数据处理的软件SPSS等,拥有无菌室和洁净级动物实验室等,能够独立完成本项目的研究工作。
②?尚缺少的条件及解决方法
基础实验楼公共仪器平台设备预约使用时间紧张,部分实验需要借助哈尔滨医科大学的研究平台完成此项试验任务。