笔杆检测报告单（全文标明引文）

大学生创新训练项目计划申请书

项目编号

项目名称 GoAstV、GPV、NDV和TMUV四重Nano-PCR检测方法的建立

项目负责人孙嘉联系电话13634876961

所在学院动物科技学院

学号20225032509专业班级动物医学

指导教师徐彬

申请日期2024年06月22日

起止年月1年期

黑龙江八一农垦大学

一、基本情况

项目名称 GoAstV、GPV、NDV和TMUV四重Nano-PCR检测方法的建立

项目级别

项目级别

项目类型创新训练项目

所属学科学科一级门:农学 学科二级类:动物医学类

选题类别新农科

是否为重点支持领域否重点支持领域

项目来源名称学生来源于教师科研项目选题

申请金额元起止年月1年期

负责人孙嘉性别男民族汉族出生年月2003-07-27

学号20225032509联系电话宅:13634876961

手机:13634876961邮箱:3065260373@qq.com

指导教师徐彬联系电话宅:13028252002

手机:1302825200职称:教授邮箱: xubin@byau.edu.cn

项目简介鹅星状病毒、鹅细小病毒、新城疫病毒和坦布苏病毒是目前鹅最重要的四种病毒,鹅星状病毒(GoAstV)更是近年来爆发的最严重的鹅新兴病毒,给鹅养殖业带来了巨大的经济损失。这些病毒导致雏鹅高发病率和死亡率,并且经常混合感染。因此,急需开发一种同时检测多种鹅重要病毒的高效检测方法。本研究拟建立一种同时高灵敏度检测四种鹅病毒的Nano-PCR检测方法,实现鹅病毒的快速、敏感和特异性检测。

负责人曾经参与科研的情况

指导教师承担科研课题情况1.新时代龙江优秀硕博学位论文立项资助项目2.黑龙江省农业科学院自拟课题—4型禽腺病毒的诊断与防治研究参加项目:4.中央支持地方高校改革发展资金人才培养项目—肠道冠状病毒中草药创制5."百千万人才"科研启动计划项目—家畜重要冠状病毒分子病原学及其关键技术研究6.黑龙江省重点研发计划项目—畜禽重要传染病快速诊断关键技术研发与推广 7.黑龙江省科研机构创新能力提升专项计划项目—兽药新药新品种开发

指导教师对本项

目的支持情况

项目组主要成员姓名学号专业班级所在学院项目中的分工

孙嘉20225032509动物医学动物科技学院主持项目负责项目设计实验操作

解一萱20225032536动物医学动物科技学院数据采集实验设计实验操作

田济源20225032506动物医学动物科技学院文献调研撰写报告

胡佳202350320315动物医学动物科技学院负责文献整理文献查阅数据分析

朱万昱20225032502动物医学动物科技学院实验操作研究论证数据分析

二、立项依据(可加页)

(一)研究目的

我国拥有悠久的养鹅历史,鹅类在中国拥有广大的消费市场。并且我国是全球第一的养鹅大国,是全世界鹅类养殖量和鹅的其他产品出口量最大的国家,占全球鹅养殖数量的80%。随着社会经济的发展,我国对各类家禽的需求量发生变化,对鹅类的需求量连年上升大量的人开始转入养鹅业养。鹅属于粮食节约型的家禽,鹅与人和其他家畜的食谱重叠小,发展养鹅业不会与人畜争粮。鉴于养鹅业的种种优势,2022年5月,黑龙江省工信厅、省农业农村厅联合印发了《黑龙江省鹅产业振兴行动计划(2022—2025年)》,以发展鹅绒深加工为着力点,推动鹅肉加工提档升级,实现鹅产业振兴。预计到2025年,黑龙江省全年商品鹅的出栏量达5000万只以上,鹅产业营业收入在100亿元以上。由于鹅的养殖规模不断扩大各类病毒以及一些新兴的病毒的感染也不断出现,在鹅类养殖的过程中病毒性疫病导致了大量的鹅类死亡,对鹅产业的发展有严重的危害。与鹅相关的病毒性疫病中的新城疫病毒(newcastle disease virus, NDV)、鹅细小病毒(goose parvovirus, GPV)、鹅星状病毒(goose astroviruses, GoAstV)和坦布苏病毒(tembusu, TMUV)是鹅病毒性感染死亡的主要病毒性病原,在实际养殖过程中鹅群发病普遍为多种病毒的混合感染,这种混合感染对鹅的致死率更高诊断更加困难。因此对病毒性病原的及时诊断对于疫病的防控至关重要。目前,针对鹅病毒性疾病的临床诊断主要通过琼脂扩散血清学检测方法,单一的PCR检测方法也偶有应用,对于现在普遍发生的多种病毒混合感染的情况,适用性不强,另外,鉴于一些新兴的病毒不断出现,诊断方法存在一定的滞后性。因此,建立针对鹅群混合感染的快速检测方法,有助于实现鹅的病毒性疾病的快速诊断,对于疾病的及时防控和诊断意义重大。

研究内容

1. GoAstV、GPV、NDV和TMUV引物设计与合成。2.单一Nano-PCR扩增GoAstV、GPV、NDV和TMUV。3.多重RT-PCR检测方法的建立及鹅病毒流行病学调查

国、内外研究现状和发展动态

1.黑龙江是养鹅大省,疾病风险是鹅健康的重要因素。在现在注重饮食健康的社会环境中,拥有优质蛋白的鹅肉以及鹅绒鹅肝等附属产品更加复合现在的中国市场。中国的鹅肉消费与生产均排在世界首位。根据世界粮农组织(FAO)数据,我国商品鹅近年平均年出栏量约6.7亿只,鹅绒产量约4万吨,占全球总量的80%以上。而根据省畜牧业协会鹅业分会调研统计,我省商品鹅平均年出栏约4000万只,可产高品质鹅绒约1200吨。分别占全国的6%和3%。到2025年预计,全省商品鹅年出栏5000万只以上,鹅产业营业收入在100亿元以上。但是,由于受鹅抗病力强的影响,我国对鹅病的研究普遍较少,饲养规模较少时,发病率较低,但随着养殖规模和密度的不断增加,鹅病的发生率大幅上升,传播以久的疾病还没有有效控制,又不断的出现新的疫病。因此,疾病风险越来越成为影响鹅健康的最重要因素,直接决定了鹅产业发展。2.鹅病毒性疾病尤其是鹅病毒混合感染是引起鹅死亡的主要病原。近年来的流行病学调查结果显示,我国常见的GoAstV和GPV是我国鹅场中常见病毒,检测阳性率为5.16%-58.21%。其中,GoAstV是我国检出率最高的病毒,阳性检出率达58.21%,是近年来我国鹅养殖中最主要的鹅病毒病原。而黑龙江省的检测结果显示了同样的结果,GoAstV阳性检出率为15%,位于第二位的GPV为9%,NDV和TMUV分别具有第三和第四高的阳性率。另外,不同病原混合感染检测结果显示,鹅群病原混合感染极为普遍,在这些混合感染的样本中多数检测到2~3种病毒的核酸,占样品总数的67.44%。[1]其中,GoAstV及GPV同时检出所占比例最大,为36.28%。以上的结果表明,鹅养殖中GoAstV、GPV、NDV和TMUV病毒可能是造成鹅死亡的最重要病毒,同时,鹅养殖中多种病毒混合感染可能是我国规模化鹅场病毒性疫病复杂化和防控难度加大的重要原因。3.鹅病毒诊断方法更新研发滞后,高效快速的检测方法亟需研发。传统上,这些病毒感染的诊断必须通过电子显微镜鉴定、免疫荧光或病毒分离;然而,这些技术耗时、费时费力,相对不敏感。此外,在某些情况下,由于缺乏抗体或合适的细胞系,这些方法可能不可能实现。单一PCR已成为直接鉴定或验证上述病毒的首选方法。已经开发了几种PCR方法。然而,使用传统的PCR技术单独检测几种病毒是耗时、费力和昂贵的。而且GoAstV作为一种新兴病毒,可靠的检测方法尚未完全建立,因此,有必要建立一种同时检测包含新兴病毒和其他3种鹅重要病毒的检测方法。近年来,纳米颗粒辅助PCR(Nano-PCR)技术得到了发展,其将纳米颗粒纳入PCR系统。纳米粒子,通常大小在1-100nm之间,包含20-15000个原子,通常具有良好的导热性,对PCR反应系统中DNA模板与引物的结合、DNA聚合酶的浓度以及反应物的聚合反应有调节作用,这大大增加了扩增效率,并降低了非特异性扩增。本研究利用新的多重Nano-PCR检测技术,结合本实验室相关的研究基础条件,开发同时检测GoAstV、GPV、NDV和TMUV的多重Nano-PCR检测方法将具有重大科学意义,能实现"一次检4毒",是快速、高灵敏鹅病毒病诊断以及及时防控的最佳途径。

(四)创新点与项目特色

本研究的顺利实施能够实现一次反应同时检测包括新兴病毒-鹅星状病毒的4种鹅常见病毒,同时在创新性将纳米颗粒纳入多重PCR反应系统,显著提高其灵敏度和特异性,从而实现鹅混合感染病毒的快速、高敏感和高特异性检测。

(五)技术路线、拟解决的问题及预期成果

1.建立能够对GoAstV、GPV、NDV和TMUV混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断的四重Nano-PCR检测方法。2.检测敏感性在103 copies/μL以上,采集并检测临床发病鹅样品数量50-100份。3.研究成果以论文形式发表,发表论文1篇。

项目研究进度安排

1.2024年6月-2024年12月资料收集,市场调研,制定总体实施计划,确立实验方案;设计合成PCR引物,进行单一Nano-PCR扩增;进行多重Nano-PCR扩增。2.025年1月-2025年12月优化多重Nano-PCR扩增条件;收集、采集临床样品并对临床样品进行多重Nano-PCR检测;总结分析试验结果,发表论文1篇,撰写结题报告。

(七)已有基础

1.与本项目有关的研究积累和已取得的成绩

2.已具备的条件,尚缺少的条件及解决方法

四、指导教师意见

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导师(签章):

年 月 日

五、院系大学生创新创业训练计划专家组意见

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专家组组长(签章):

年 月 日

六、学校大学生创新创业训练计划专家组意见

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负责人(签章):

年 月 日

七、大学生创新创业训练计划领导小组审批意见

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导师(签章):

年 月 日